PH0421-TMB显色试剂盒(ELISA HRP显色用)操作手册_百度文库
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PH0421-TMB显色试剂盒(ELISA HRP显色用)操作手册
&&TMB显色试剂盒(ELISA HRP显色用)操作手册
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南京金益柏elisa试剂盒操作步骤如何？
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& & & ELISA试剂盒操作步骤：关于elisa试剂盒的具体操作步骤：　　1．取出试剂盒室温平衡30min，取出血样放至室温。　　2．配标准品：取150uL标准品加入150uL标准品稀释液稀释，依次稀释5次。　　3．加样：分别于各反应孔中加入标准品50uL，样品40UL，标准品做复孔，样品做3孔。　　4．分别于样品孔中加入10UL抗体。　　5．标准品和样品孔中分别加入50uL链酶亲和素-HRP，盖上封板膜,轻轻震荡混匀，37℃温育60min。　　6．配洗涤液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用。　　7．洗涤：小心揭开封板膜，弃去液体，甩干，每孔加200uL洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。　　8．显色：每孔先加入显色剂A 50uL，再加显色剂B 50uL，轻轻震荡混匀，37℃避光显色6min。　　9． 终止：每孔加入终止液50uL，终止反应（此时蓝色立即转为黄色）。　　10．测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度。测定应在加终止液10min之内进行。　　11．保存结果，收拾桌面。　　12．分析处理数据　　注意事项　　1. 取出板条前恢复到室温后再打开外包装袋，实验中不用的板条立即放回包装中，密闭封口，其余不用试剂应盖好。　　2. 实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。　　3．实验板孔加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应孔的孵育时间一致。　　4．洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上充分拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水。　　5．试剂盒内试剂请在保质期内使用，不同批号试剂不要混用。　　6．1000pg/ml以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。大于1000pg/ml 的样品应以标准稀释缓冲液稀释后重做。在结果分析时，结合考虑相应的稀释度。
　　楼主应该根据条件选择ELISA试剂盒。　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。由于ELISA试剂盒里的试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。　　由于ELISA试剂盒种类繁多，下面小编就教大家如何根据条件选择合适的试剂盒：　　（1） 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。　　（2） 包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，小鼠ELISA试剂盒时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃ 18～24小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg/ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg/ml。　　（3） 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接ELISA法进行初步效价的滴定（见酶标记抗体部份）。然后再固定其它条件或采取“方阵法&（包被物、待检样品的参考品及酶标记抗体分别为不同的稀释度）在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。　　北京标准物质网　　
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中国生物器材网 电话：021-D）ELISA试剂盒操作步骤
文章来源：网友提供 　文章作者：网友110 　发表时间：
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本试剂盒采用双抗体夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人莱姆病（Lyme-D）。用纯化的人莱姆病（Lyme-D）抗体包被微孔板，q，制成固相抗体，可与样品中莱姆病（Lyme-D）相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的莱姆病（Lyme-D）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，n，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，l，并在酸的作用下转化成最终的黄色。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人莱姆病（Lyme-D）的存在与否。
试剂盒组成：
试剂盒组成 &
48孔配置 &
96孔配置 &
2片（48） &
2片（96） &
酶标包被板 &
2-8℃保存 &
阴性对照 &
0.5ml×1瓶 &
0.5ml×1瓶 &
2-8℃保存 &
阳性对照 &
0.5ml×1瓶 &
0.5ml×1瓶 &
2-8℃保存 &
酶标试剂 &
3 ml×1瓶 &
6 ml×1瓶 &
2-8℃保存 &
样品稀释液 &
3 ml×1瓶 &
6 ml×1瓶 &
2-8℃保存 &
显色剂A液 &
3 ml×1瓶 &
6 ml×1瓶 &
2-8℃保存 &
显色剂B液 &
3 ml×1瓶 &
6 ml×1瓶 &
2-8℃保存 &
3ml×1瓶 &
6ml×1瓶 &
2-8℃保存 &
浓缩洗涤液 &
（20ml×20倍）×1瓶 &
（20ml×30倍）×1瓶 &
2-8℃保存 &
样本处理及要求：
1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，t，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，p，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，t，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，k，用无菌管收集。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，n，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），埃及猫，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，x，但应避免反复冻融.
7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤：
编号：将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔、阳性对照2孔、空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）
加样：分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50μl。然后在待测样品孔先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，
温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 &&
配液：将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水至600ml后备用
洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。
温育：操作同3。
洗涤：操作同5。
显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，苏格兰折耳猫，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟
终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。
测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。&测定应在加终止液后15分钟以内进行。
结果判定：
试验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00; 阴性对照平均值≤0.10
临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.15
阴性判定：样品OD值&&临界值（CUT OFF）者为人莱姆病（Lyme-D）阴性
阳性判定：样品OD值≥&临界值（CUT OFF）者为人莱姆病（Lyme-D）阳性
1．操作严格按照说明书进行，本试剂不同批号组分不得混用。
2．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。
3．浓洗涤液可能会有结晶析出，c，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。
封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5．底物请避光保存。
6．试验结果判定必须以酶标仪读数为准，，使用双波长检测时，参考波长为630nm
7．所有样品，贵宾犬，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。终止液为2M的硫酸，使用时必须注意安全。
保存条件及有效期
1．试剂盒保存：；2-8℃。
2．有效期：6个月
D）ELISA试剂盒操作步骤由网友110发表于，本文地址：http://www.skycn1.com/chongwugouchangshi/31612.html - ，如感兴趣可进入：《》查看更多与《D）ELISA试剂盒操作步骤》相关的内容。
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