税务局调查范冰冰，一切才刚刚开始！
综合自：长安街知事、麻辣剧社、本地头条、老歌回放
6月3日，因崔永元曝光范冰冰4天6000万天价片酬而起的“娱乐圈阴阳合同偷漏税事件”有了新进展。针对近日网上反映有关影视从业人员签订“阴阳合同”中的涉税问题，国家税务总局已责成江苏等地税务机关依法开展调查核实。由于范冰冰工作室在无锡。无锡市滨湖区地税局目前已经介入该事件调查取证，相关情况有待后续由税务机关权威发布。
不过税务部门的反应还是慢了一点，因为——范冰冰已经早就跑到美国去了。
5月28号，崔永元刚刚发出微博曝光范冰冰的阴阳合同后，第二天下午，有人就看到范冰冰和李晨已经在去美国的路上了。据知情人爆料说是去美国旅游。真的是去旅游？ 怎么这么巧？ 逃税证据刚刚曝光人就出国？ 《手机2》不是刚拍了吗? 拍的不是还很开心吗？ 怎么突然就去旅游了？
连日来，崔永元怒怼范冰冰一事持续发酵。除了沸沸扬扬的个人恩怨，令人咋舌的天价片酬，明星通过“一阴一阳大小合同”公然偷税漏税等行业内幕也随之浮出水面，一时间成为引爆舆论的焦点。
崔永元不仅仅得到网友支撑，连北京大学著名法学教授贺卫方也站出来在微信朋友圈力撑小崔：“我人微言轻，加上无处发声，只能在这里说一句：支持崔永元！”
6月3日凌晨，娱乐圈人士黄毅清直接爆料：“大小合同属实。冰冰这么些年偷税漏税少说5亿，重点查她妈妈账户，我以前打款大多数都是到她妈妈账户。”如果这名网友爆料为真，范冰冰至少偷税漏税5亿元。要想查清如此天文数字的逃税款，无锡市地税局尽管是范冰冰工作室所在地的税务局，应该主动提请国家税务总局查处范冰冰涉税案。
范冰冰控股多达13家公司，税务局有的忙了！
倘若崔永元曝光的大小合同确有其事，那么这件事的性质就不仅是明星天价片酬的行业乱象，更是涉及巨额税款偷漏的重大违法行为。而牵涉其中的纳税人和扣缴义务人，面临的不仅是罚款，还可能是牢狱之灾——
《刑法》第二百零一条对逃税罪明确规定：纳税人采取欺骗、隐瞒手段进行虚假纳税申报或者不申报，逃避缴纳税款数额较大并且占应纳税额百分之十以上的，处三年以下有期徒刑或者拘役，并处罚金;数额巨大并且占应纳税额百分之三十以上的，处三年以上七年以下有期徒刑，并处罚金。
其中规定，经税务机关依法下达追缴通知后，补缴应纳税款，缴纳滞纳金，已受行政处罚的，不予追究刑事责任；但是，五年内因逃避缴纳税款受过刑事处罚或者被税务机关给予二次以上行政处罚的除外。
昨晚（6月3日），有一篇来自“火星实验室”的文章称，对崔永元进行了专访。内文指出，崔永元明确表示“4天6000万片酬合同”所指并非范冰冰，并向受到牵连的范冰冰、徐帆、刘震云女儿刘雨霖三位女性道歉。
崔永元还透露，影视行业偷税漏税现象比大家想得严重得多，涉案金额远超目前曝光金额的10倍以上。至于5月28日微博中所曝光的涉事明星，他透露并非是一个人，而是“一个团伙”，并透露该团伙涉及到此次《手机2》。
崔永元曝光阴阳合同一事，或许只是揭开了明星避税逃税的“冰山一角”。
如果范冰冰这次偷税漏税之事确凿，娱乐圈潜规则证明肯定还不止范冰冰一人偷税漏税——明星大肆偷漏税，这个行业要彻查！税务机构不但要侦办范冰冰，也不能放过冯小刚、徐帆、刘震云等相关人士。
如果是“潜规则”，那事情就更复杂了，有关部门对此“睁一只眼闭一只眼”，还给出一种令人啼笑皆非的“逻辑”——默认“逃税”即是留住“税收”。
说起偷税漏税就不得不提内地影视圈大姐大刘晓庆，刘晓庆创办的晓庆文化艺术有限责任公司自1996年以来采取不列或少列收入、多列支出、虚假申报等手段偷税漏税多达1500万，最终法院以偷税漏税罪判处刘晓庆1年有期徒刑，该事件曾轰动全国，成为演艺圈的一大丑闻。
其次就是乐坛大姐大毛阿敏，1989年，毛阿敏在黑龙江演出5天，赚了6万，却偷税漏税4万，引起了全国的公愤，面对税务机关，毛阿敏无言以辩，所有的罚款都由一个人默默地承担下来，据悉当时的罚款总额达到60多万，5年后，毛阿敏再次陷入税案风波，根据新华社当时的通稿，毛阿敏因漏税，需补缴的税款为27万。 更要命的是因为此风波令他的名誉受损，人气下降，几乎有半年时间没有接到任何单位敢邀请她做节目，在税案风波发生之后的一段时间里，毛阿敏的神经近乎崩溃，她已经无法承受来自媒体的巨大压力，于是她想到了自杀，幸亏家人及时发现才被抢救过来，后来，毛阿敏远赴英国疗伤，4年之后才复出歌坛。
此外，还有韦唯、欧弟、吴宗宪、张惠妹、大小S、任贤齐等明星都因逃税被税务部门处罚过。
基本上，逃税都已经成为了影视娱乐行业的一个潜规则。而为了逃税，他们也是想出了各种千奇百怪的方法吗，被大家调侃为“花式逃税”。
除了收取税后款，转嫁纳税责任，还包括在避税地或者低税率地区注册公司、阴阳合同、慈善捐款等等。
不说别的，就一点：这些年为什么明星工作室越来越多了？其一部分的原因在于可以避税。明星基本都是以工作室的名义对外承接广告、拍片等业务。从税收来看，工作室属于个人独资企业或者有限合伙企业，通俗的解释就是类似工商户，缴税就是按照工商户缴纳。纳税时因为影视公司的很多成本没有发票，会计账簿不健全，所以进行合并征收，就是合并个人所得税。而这些明星通过在税收优惠地区注册公司，可以享受税收优惠，从而进行避税。
除了在形式上寻求变通，不少明星还在地理位置上求变通。近年来，备受明星和影视公司青睐的避税天堂是霍尔果斯。2011年“一带一路”战略提出后，新疆霍尔果斯成为“经济特区”，实行免税政策，除此之外，更是提供了注册公司快速上市的“绿色通道”。
有媒体曾算了这样一笔账：据现行企业会计准则，假如某影视公司年营业额1亿元，该企业一年需缴纳各种税额877.2万元。但在霍尔果斯，能节省税款近300万元。此外，对动辄片酬上千万的明星来说，霍尔果斯的个税优惠的确能让此地成为“避税天堂”。
从2011年至今，来自内地的影视文化类企业在霍尔果斯注册的有1600多家。据中国电影产业报道，明星直接担任法人或间接控股的包括吴秀波、黄渤、赵本山、李湘、刘涛、陈建斌、王学兵、张嘉译、徐静蕾、梁静、吴奇隆、范冰冰、陈坤、关悦、胡军等。
据当地税务部门向相关企业公布的一项统计，每年至少有200家企业各自向霍尔果斯注册子公司转移2000万元以上利润。
霍尔果斯只是一例，把国家重点培育的经济重镇当做“避税天堂”的，肯定还有不少。天下熙熙，皆为利来。恐怕不少人因此生出“查的太严，人就跑了”的念头，还把它当成了看似“合理”的解释，自我麻痹。
据《法制日报》消息，无锡市滨湖区地税局目前已经介入该事件调查取证，相关情况有待后续由税务机关权威发布。
崔永元 曝范冰冰4天6000万天价片酬，并起底疑似大小合同、阴阳合同等偷漏税等潜规则，日前有了最新进展。《法制日报》记者了解到，由于@范冰冰工作室在无锡，无锡市滨湖区地税局目前已经介入调查取证，相关情况有待后续由税务机关权威发布。权威法学专家认为，如果税务机关调查阴阳合同客观存在且行为人涉嫌逃税，应当依法下达追缴通知，责令补缴并缴纳滞纳金，涉嫌犯罪的应移送公安机关。记者了解到，看似娱乐八卦的央视前主持人崔永元怼明星范冰冰的新闻，实际上看起来更像是举报。
5月28日，崔永元发微博称：你不用表演，你是真烂！（附有几张合同照）
5月29日11:02，崔永元在微博中称某演员（暗指范冰冰）演戏签两份合同“一小一大双合同”，小合同千万酬劳，不怕曝光。而大合同则有五千万。
范冰冰实际上签了两份合同，“不怕曝光的小合同”价值千万，而另一份隐藏的“大合同”价值5000万，也就是说，范冰冰演一部戏拿了6000万片酬，而崔永元还称该演员“这也不行那也不干”，拿下六千万以后“这哥们儿只在片场演了……4天”。 　　
倘若崔永元曝光的大小合同确有其事，那么这件事的性质就不仅是明星天价片酬的行业乱象，更是涉及巨额税款偷漏的重大违法行为。而牵涉其中的纳税人和扣缴义务人，面临的不仅是罚款，还可能是牢狱之灾——
《刑法》第二百零一条对逃税罪明确规定：纳税人采取欺骗、隐瞒手段进行虚假纳税申报或者不申报，逃避缴纳税款数额较大并且占应纳税额百分之十以上的，处三年以下有期徒刑或者拘役，并处罚金；数额巨大并且占应纳税额百分之三十以上的，处三年以上七年以下有期徒刑，并处罚金。
其中规定，经税务机关依法下达追缴通知后，补缴应纳税款，缴纳滞纳金，已受行政处罚的，不予追究刑事责任；但是，五年内因逃避缴纳税款受过刑事处罚或者被税务机关给予二次以上行政处罚的除外。
崔永元怒撕范冰冰，或许只是揭开了明星避税逃税的“冰山一角”。
南京师范大学法学院院长、博士生导师蔡道通教授认为，税务机关有义务将此作为重要的案件线索，查明是否存在这一阴阳合同的事实，范冰冰或者扣缴义务人是否涉嫌逃税？甚至，是否属于单纯孤立的个案，还是普遍存在的演艺界的“潜规则”。
崔永元曝光范冰冰阴阳合同一事，还扯出了范冰冰2010年领过一个“国家精神造就者荣誉”奖。这个奖项光看字面就不得了，“国家精神造就者"，完全就是一个高大上奖项，堪比”全国劳模”、“感动中国”等荣誉。
然而，网上一查，这个奖项的主办方是奔驰公司和传媒集团的《生活》月刊，获得者大多数是娱乐圈明星和商界的名人富豪。
在其介绍上有这样一句话“获奖者所拥有的顽强意志，强大力量和激扬的梦想与也正是AMG的理念精髓。”
从中不难看出，在本质上这其实就是一个挂着颁奖形式的汽车广告。却用上“国家精神"这样一个非常“官方”的称号。
目前这个奖还一直在举办。我们要知道“国家”这一个词是不能乱用的，只有国务院设立的奖才能以“国家”开头，比如“国家最高科学技术奖”、“国家自然科学奖”、“国家技术发明奖”、“国家科学技术进步奖”等。
那么，这个“国家精神造就者荣誉”奖，一个纯商业性质的奖项，也用”国家“开头，明显就是混肴视听，存在滥用“国家”一词的情况。也不知道该哪个有关部门出来管一管？
当前，无论是商界还是艺术界、体育界。有非常多的名人或者企业热衷于拿奖，希望以此得到社会的肯定。
这也催生了一大批以盈利为目的的山寨奖项。只要交钱，就可以参与评奖，而评委在相关领域的水平连业余都算不上。
最著名的还得是”孔子和平奖“，它的主办机构和大多数的山寨组织一样，注册地都在香港。这个奖自2010年开始，连战、普京、袁隆平、科菲·安南、一诚法师、卡斯特罗先后获奖，但仅有一诚法师领奖，而其他的获奖人都拒绝领奖。文化部曾多次叫停该奖项，并表示该“奖项与中国政府没有一丁点的关系”。但这个奖也是一直被叫停，还一直在举办。
另外，主持人倪萍获得了“共和国脊梁“奖，事后证实，此奖只要交9800元，在读的各位都可成为”共和国脊梁“的侯选人。这些还只是冰上，尤其是在企业界，类似的例子数不胜数，”评奖产业“已经发展的比较成熟，并具有一定的规模。
什么是中国的“国家精神"，是勇敢、执著、奉献，传统文化之精华，重申仁爱、谦恭、自强、自省、和谐等观念；
是中华民族传统的勤劳、善良、热爱、无私奉献精神的象征；
是中华民族顶天立地、吃苦耐劳、任劳任怨、自觉自信、自强不息、厚德载物精神的载体；
是中华民族伟大复兴所必须的自信、自觉、自强、自豪的民族性格，继承、追求、弘扬、创造的一种精神，是我们所需要的一个精神家园。
中国“国家精神"博大精深，它可以涵盖中华民族的智慧、勤劳、勇敢、爱国主义、热爱和平、不屈不挠、自强不息以及自由、平等、博爱;是中华民族现代的勇敢、坚强、正义、敢于担当和热爱祖国、热爱人民的民族精神。
这些精神，是那些纸醉金迷，收入亿万的戏子们缔造的吗?
而当我们看到小崔后续曝光的范冰冰的工资待遇后，更是为之震惊！
一个演员，赚到如此多的天量财富，让那些做着“实业兴邦”“科技兴邦”的“强国富民中国梦”的人瞬间失望崩溃，在毁灭了公平的同时，是否也会毁灭了这个民族崛起的希望！
是谁在支撑着国家的“强国梦”？是谁在支撑着社会的进步？是戏子们吗？
众所周知，科学家的重大发明几乎是造福人类，几十亿人生活受益，但是目前科研经费及奖励也就个几百万，还不如明星参加个真人秀，拍个广告赚钱。
没那几个明星的电影和节目可以说对生活毫无影响，可是生活中，缺少了某项重要发明真的极为不便的。现在价值观是不是扭曲了，科学家地位远不如演艺明星，这是时代的悲哀！
在我们还吃不饱穿不暖的时候，世界列强就对我们虎视眈眈。是科学家不懈的努力，是两弹一星的发射上天，让我们成了军事强国，列强们从此不敢再小视我们，我们的国防有了坚实的盾牌。那个时候，人们崇尚科学，迷恋科学。
当年，孩子念书的最高目标就是当科学家。也因为那个时候的倡导，带来了今天科技的繁荣。
但这些年，畸形的财富分配让社会似乎已经失去前进的动能。社会分层严重，固化加剧，财富流动极不正常：
随着市场经济的全面渗透，娱乐圈野蛮生长，就像一朵奇葩，绽放异彩。媒体成天都是明星八卦，追星成了孩子们的全部，偶像的崇拜成了孩子的最高目标。【点此处，看大学教授悲催经历】
为了见到偶像，孩子们可以不远万里不吃不喝，放弃学业，放弃前程。这就是一种病态。其中的根本原因是因为科学家和演艺明星的地位和待遇的不同造成的。
一个浮躁的社会，人们追逐的都是表面的光鲜亮丽，于是各种包装炒作，让人们失去了自然和本真，浮躁的气息扩散到每一个角落，使得现代人已经不再关注生活的本源，而是追求虚无的奢侈浮华。
讲排场追名牌不遗余力，比房比车比表比包包，攀比之风盛行。而演艺明星则是这个时代的宠儿，他们享受粉丝们的追捧，享受身上的虚幻的光环。
进而恶性膨胀，吸毒，嫖娼，乱性，而不知羞耻，这对粉丝们的影响是深刻的。他们忘了作为公众人物应该负起的社会责任。
那些终生投身科研的科学家，大多都是身居陋室，连钱学森都是住百八十平米的旧房子。而大明星们，差不多都有几处豪宅，出行坐豪车，经纪人保镖随从前呼后拥。
媒体成天报道，广告收入达到七八位数，像天上掉馅饼一样容易。这种现象的存在，让成长过程中的孩子难以形成正确的价值观人生观。
孩子们都已经变得很现实，觉得搞科研是没有出息的。他们的人生目标不是升官就是发财，而当明星更是名利双收。
于是为了出名，什么事情都可以做的出来，根本没有底线。这就是我们当今的社会，价值观严重的扭曲。科学家地位远不如演艺明星，这是时代的悲哀。
许多成就斐然的科研工作者，大多像这些院士们一样，贡献斐然，却淡漠名利，勤俭节约。他们的收入不及明星的千分之一，却做着服务人民，建设国家的伟大事业。
他们才是中国最有资格荣获“国家精神造就者”的先锋，他们就像一面镜子，照出了时代变革里人们精神境界的高下，他们也是一把标尺，矫正着时代迷茫里中国人追求的方向！
新时代，新机遇，我们倡导改革，而我所理解的改革，即是一切有碍国家发展人民福祉并被实践证明是错误的理论，都需要及时修正！在改正错误中前进...
娱乐之上，名利之上，英雄和伟人屡遭诋毁的时代，是时候纠正了！网友愤怒范冰冰获“国家精神造就者奖”的背后，是希望让真正的国家精神造就者被国人知晓，让真正的英雄成为国家的脊梁！
演员，古代叫戏子。是专门供达官贵人娱乐消遣之用，地位低下，处于九流中的“下九流”，有句俗话叫“婊 & 子无情，戏子无义”，说这句话并不是妒忌她们今日的地位，而是说这些人永远都只会逢场作戏，她们真实的“人生不可能如戏”般打动你。
但是中国的文艺市场已经沦为了灰色地带的重灾区，洗钱、逃税、权色交易，以前是坑煤老板去捧，现在是资本市场去捧。
由于娱乐行业的自律和监管目前属于放任自流，必须加强监管的机制应该及时跟上！
一个健康的中国，需要一个健康的文艺市场，中国的崛起，更离不开科学家家。中国政府应该负起责任，尽快马上矫正科学家地位不如戏子(明星)的乱象。
今天，科学家们穷尽一生蜗居在陋室，不舍昼夜为国家创新竭尽全力，取得巨大成就却无人知晓，无人感谢。
而在真正的英雄和伟人屡屡遭受诋毁的今天，一个戏子却被公然推到“国家精神造就者”的地位？！
由此，让我们好像懂得了，为什么真正的英雄会遭受诋毁，为什么真正的英雄会被无视，为什么真正的英雄会如此心酸！
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今日搜狐热点&范冰冰阴阳合同最新进展：税务总局发话！无锡地税已调查
范冰冰阴阳合同最新进展：税务总局发话！无锡地税已调查
日10时52分来源：
整合自北京日报、每日经济新闻、中国基金报、法治江苏
连日来，崔永元怒怼范冰冰一事持续发酵。除了沸沸扬扬的个人恩怨，令人咋舌的天价片酬，明星通过“一阴一阳大小合同”公然偷税漏税等行业内幕也随之浮出水面，一时间成为引爆舆论的焦点。
事情最新进展：税务总局彻查，无锡地税紧急行动
6月2日，崔永元微博有了新的爆料：“我家铲屎官说，这就是大小合同。小的是演出200万，大的是策划监制748万加90万，再拿一麻袋现金。这还不算一线的。我家铲屎官说，好像有个法律管这事儿。老有人通知我家铲屎官小心安全，我也得躲好。”
崔永元还直接点出“好像有个法律管这事儿”，并截图《刑法》条文。崔永元明示事件走向预期——将最后由法律定调。这对范冰冰方面来说，无疑“亚历山大”。
《刑法》第二百零一条：纳税人采取伪造、变造、隐匿、擅自销毁账簿、记账凭证，账簿上多列支出或者不列、少列收入，经税务机关通知申报而拒不申报或者进行虚假的纳税申报的手段，不缴或者少缴应纳税款，
偷税数额占应纳税额的百分之十以上不满百分之三十并且偷税数额在一万元以上不满十万元的，或者因偷税被税务机关给予二次行政处罚又偷税的，处三年以下有期徒刑或者拘役，并处偷税数额一倍以上五倍以下罚金；
偷税数额占应纳税额的百分之三十以上并且偷税数额在十万元以上的，处三年以上七年以下有期徒刑，并处偷税数额一倍以上五倍以下罚金。
扣缴义务人采取前款所列手段，不缴或者少缴已扣、已收税款，数额占应缴税额的百分之十以上并且数额在一万元以上的，依照前款的规定处罚。
对多次犯有前两款行为，未经处理的，按照累计数额计算。
事情发展得很快，崔永元昨天中午发微博，今天（6月3日）上午，《法制日报》报道称，无锡市滨湖区地税局目前已经介入调查取证，相关情况有待后续由税务机关权威发布。权威法学专家认为，如果税务机关调查阴阳合同客观存在且行为人涉嫌逃税，应当依法下达追缴通知，责令补缴并缴纳滞纳金，涉嫌犯罪的应移送公安机关。
今天下午，国家税务总局表示，针对近日网上反映有关影视从业人员签订“阴阳合同”中的涉税问题，国家税务总局高度重视，已责成江苏等地税务机关依法开展调查核实。如发现违反税收法律法规的行为，将严格依法处理。
随后，江苏省地税局和无锡市地税局也表示已经开始调查核实。
崔永元所说的“大小合同”其实就是各级税务机关所说的“阴阳合同”：交易双方签订金额不同的两份合同，一份金额较小的“阳合同”用于备案登记纳税；另一份金额较高的“阴合同”则实际约定双方交易价格。
此前，一位影视行业资深人士向每日经济新闻表示：
（阴阳合同）这是避税的一种方法，严格讲不合法，费用比较高的一些人会用。但是，现在很多地方有优惠政策，税点本来就比较低，所以没有以前那么多了。而且，一般来说强势的明星、大明星有议价的资本，只要税后收入，税款由制作公司来交。所以，有时往往不是明星要做，是制作公司要降低成本，去做“AB合同”，明星越是大牌，越是风险意识更强，他的整个团队不会允许他去冒这个风险，按我的判断来看，这个“大小合同”不太可能是范冰冰这种级别的，“大小合同”是很危险的，也许是完全没有经验，对法律不了解才会犯这种错。
今天下午，国家税务总局公告发出后，成都商报联系了崔永元，他表示，自己已经从网络知晓了此事。不过在他看来，无锡当地税务部门如果真要调查此事，首先应该给自己联系核实。
此外，今天下午5点10分，每日经济新闻记者反复致电崔永元后，得到崔永元的回应：“我现在没有时间接受采访，我正在跟当事人通话，解决这些事情。”
今晚六点左右，《每日经济新闻》记者又一次拨通了崔永元的电话。
崔永元在接受《每日经济新闻》记者专访时表示，现在他正在与主管部门协调怎么见面、在哪见面、如何取证等具体细节。“你等等吧，差不多一周左右就会有消息。”“等着呗，国家税务总局都开动了，就等着呗。”
这件事是否会成为中国影视行业明星税收改革的标志性事件？崔永元告诉《每日经济新闻》记者，“我都没有想过，这些跟我没有关系。谁知道这事怎么就点燃了。”
同时，成都商报记者多次拨打范冰冰工作室工作人员电话，同时发去短信，试图采访范冰冰方面。截至目前，他们暂未对此事做出回应。
事件回顾：崔永元手撕范冰冰，范冰冰发声明：诽谤！
今年5月10日，冯小刚新片《手机2》开拍，主打的是《手机》原班人马回归，冯小刚导演、刘震云编剧、葛优、范冰冰等人主演，既有消费外界怀旧情怀，也有新元素。
正是这部电影惹怒了崔永元。电影《手机》讲述了事业如日中天的电视主持人严守一因为手机给他的生活带来快乐、带来爱情的同时，也使他的婚姻遇到了很大的危机。
严守一的饰演者是葛优，在片中主持一档《有一说一》的电视节目，处处带着崔永元和《实话实说》的痕迹，江湖传言冯小刚和刘震云创作《手机》过程中，数次请教崔永元制作节目详情。
电影中严守一出轨、离婚等负面新闻发酵至现实社会中，让崔永元饱受苦恼，经常被吃瓜群众指责，崔永元也因此患上抑郁症，用崔永元的话说，这部电影给自己带来了无尽的灾难。
因此《手机2》刚宣布开拍的时候，崔永元就和编剧刘震云沟通，希望对方不拍，免得给自己带来进一步影响，但是拍摄计划一直在按计划进行下去。
于是崔永元开始了群怼模式，不仅公开怼刘震云、刘震云女儿，还怼冯小刚、徐帆夫妻，以及该片主演范冰冰。
前几条微博都不温不火，直到5月28日，崔永元通过微博发布了几张演艺合同照片并配文：“你不用表演，你是真烂”，合同中因有范冰冰名字，其中曝光合同约定片酬为税后1000万元。一天后崔永元又再度曝范冰冰采用“大小”合同，另行约定片酬5000万元，两合同共拿走片酬6000万元，而实际上范冰冰只在片场演出4天。
范冰冰方面发布了一则“严正声明”，称崔永元侵犯合法权益，散布谣言，构成诽谤。范冰冰工作室回应，公开发布泄密合同并公然侮辱范冰冰的行为，既破坏了商业原则，又涉嫌侵犯合法权益，并称相关网络用户及媒体未经核实散布谣言的行为已经构成诽谤。
对此，崔永元则迅速回应称没有保护合同秘密义务，范冰冰是公众人物，如不服，可以“出来走两步”，对公众“实话实说”。
事件影响：华谊唐德等上市公司受影响，明星税收将受影响事情发展到现在，已经不再只是一场娱乐圈的互撕，其产生的影响也将辐射到方方面面。
首先，作为《手机2》的出品方，华谊兄弟势必会受到一定的影响。
从华谊兄弟官网来看，《手机2》或是其今年主打电影之一，毕竟《手机》曾拿下2003年内地华语电影票房冠军。有市场人士五月底的时候发微博表示，崔永元怼《手机2》剧组，很可能怼出事情来。果不其然，早在5月28日崔永元曝光1000万片酬之际，华谊兄弟股价由升转跌。随后两日，华谊兄弟股价也是连续下跌，跌幅超过5%。
除了华谊兄弟，唐德影视可能会成为另一个受到此事牵连的上市公司，这主要是由于唐德影视与范冰冰深度的绑定关系。
据天眼查，范冰冰控股参股及与其相关的公司共有13家，有5家公司的法人是范冰冰本人，其中，最为显眼的当属无锡唐德文化传媒有限公司，这家公司的股东之一正是市值达66亿元的上市公司浙江唐德影视股份有限公司。
2016年，唐德影视出资与爱美神共同成立了无锡唐德文化传媒公司，目前爱美神和唐德股权占比为51%和49%。目前，范冰冰持有6,449,605股唐德影视股份，日，范冰冰持有的股权迎来解禁期。不过，唐德影视今年一季报显示，范冰冰并未出售股份。
此外，崔永元“撕”范冰冰，只是揭开了明星避税逃税内幕的冰山一角。这不仅仅在中国，在全世界都是一个关注度极高而又敏感的问题。从现实来看，明星由于片酬畸高、收入来源多样，由此衍生出的避税、逃税等渠道更是五花八门。
倘若崔永元曝光的大小合同确有其事，那么这件事的性质就不仅是明星天价片酬的行业乱象，将会成为涉及巨额税款偷漏的重大违法行为。
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文娱商业观察范冰冰在无锡地税调查前，为何去美国？
范冰冰在无锡地税调查前，为何去美国？
来源:雄韬生活(xiongtaoshenghuo)
6月3日，《法制日报》独家报道无锡市地税局正介入调查崔永元微博爆料艺人范冰冰涉嫌逃税案。连日来，小崔（注：崔永元的央视主持人名号）怒怼范冰冰、冯小刚徐帆夫妇和刘震云小团伙事件，在多数海内外网友的关注与支持下，终于有了初步的实质进展。
得道多助，失道寡助！
小崔不仅仅得到网友支撑，连北京大学著名法学教授贺卫方也站出来在微信朋友圈力撑小崔：“我人微言轻，加上无处发声，只能在这里说一句：支持崔永元！”
小崔轻易爆料范冰冰4天片酬6000万元涉嫌逃税案，表明范冰冰并非唯一一次可能逃税。她出道多年，吃瓜群众的贫瘠限制了想象，自然想不出范冰冰究竟总共逃了多少个税，国家流失了多少财富？
6月3日凌晨02:44，娱乐圈人士黄毅清直接爆料：“大小合同属实。冰冰这么些年偷税漏税少说5亿，重点查她妈妈账户，我以前打款大多数都是到她妈妈账户。”如果这名网友爆料为真，范冰冰至少偷税漏税5亿元。要想查清如此天文数字的逃税款，无锡市地税局尽管是范冰冰工作室所在地的税务局，应该主动提请国家税务总局查处范冰冰涉税案。
6月3日央视报道，国家税务总局责成江苏等地税务机关调查核实有关影视从业人员“阴阳合同”涉税问题。不过，我们仍然建言，国家税务总局调查范冰冰涉税案，不仅查范冰冰工作市，也查范冰冰的母亲和经纪人穆晓光（真名“牟广恩”），查清范冰冰有没有将偷税漏税的资金转移海外？
即使仅仅计算小崔目前曝光的范冰冰4天6000万元片酬，我们首先算清她应该承担多少金额的补缴税款、交纳滞纳金和处以罚款等行政责任。根据《个人所得税法》和《税收征收管理法》的相关规定，范冰冰至少要程度1亿元以上综合性罚款。
倘若黄毅清爆料范冰冰至少偷税漏税5亿元属实，吃瓜群众已经我伙呆，不再计算她的行政责任款，就让国家税务总局条分缕析去处罚范冰冰吧！
另外，范冰冰由于涉税将会受到怎样的刑法？反正，电影明星刘晓庆偷税坐牢已是前车之鉴，影响力级别不够她的范冰冰自个掂量掂量。吃瓜群众不愿花脑筋推算，叫她的辩护律师去演算。我们乐当吃瓜群众，坐等围观公安机关协同税务机构一起办案。
小崔手撕范冰冰、冯小刚徐帆夫妇和刘震云，揭露出娱乐圈触目惊心的偷税黑洞。税务机构不但要侦办范冰冰，也不能放过冯小刚、徐帆、刘震云等相关人士。
当下的娱乐圈堕落成了黄赌毒+偷税洗钱+明星沦为公共裙带的肮脏地。国家应该整肃娱乐圈了！
因此，我们建议公安部出动调查娱乐圈严重的洗钱犯罪。公安部+国家税务总局应该以范冰冰涉税案为切入口，及时出动整肃龌龊的娱乐圈。
公安与税务机关能不能侦办范冰冰，目前是一个未知数。只因为范冰冰在小崔公开她的阴阳合同照的时日已经去往美国，有点蹊跷。
无论范冰冰会否滞留美国不归，公安部联合国家税务总局应当询问小崔，提取一抽屉的娱乐圈人士阴阳合同材料，掀起一场整顿娱乐圈的风暴。
娱乐圈人士一边纸醉金迷、放纵糜烂，而另一边中小学教师此起彼伏讨薪。这，究竟是一个什么样的时代？从而，吃瓜群众强烈呼吁整肃娱乐圈，让暴风雨来得更猛烈吧！
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要 生物监测是环境监测重要部分，当前我国环境监测主要依赖化学分析监测，近年来虽然国际上生物监测技术发展比较迅猛，但基于我国环境监测标准限制，我国生物监测发展一直处于研究阶段，当前生物监测主要依赖于藻、溞和鱼类水生生物物种，对于大型底栖生物目前监测仅依赖于生物多样性调查，因此亟待发展我国水生实验生物，尤其需要加强大型底栖生物生物标志物筛选以及模式化研究。因此本文采用我国广泛分布的软体动物河蚬作为实验生物，为加强其背景生物学研究，系统研究了河蚬生物标志物，最后利用上述标志物探讨了环境污染物对河蚬作用机制。 主要研究内容与结果如下： 1）利用Illumina技术获得了河蚬miRNA信息转录组信息，获得了条高质量序列，鉴定了45条保守的和39条新的河蚬miRNAs；荧光定量PCR定量结果表明12个miRNA中9个miRNAs在腹足中表达量最高，而miR-10和Novel-2各自在鳃和内脏团中表达最高；预测软件结果发现miRNAs和环境污染相关基因相关，为河蚬作为实验生物提供了分子生物学基础。 2）采用RACE技术，成功克隆获得河蚬CCK, Conopression和FFamide的全长 cDNA 序列， 预测了河蚬CCK, Conopression和FFamide蛋白的分子结构特征，并分析了神经肽在河蚬不同组织中的表达分布；有机磷酸酯对神经肽显著调节，表明了CCK, Conopression和Ffamide适合作为河蚬生物标志物，为环境污染物生物监测提供技术手段。 3）结合转录组测序技术和荧光定量PCR技术分析了典型有机磷酸酯（TDCPP和TBP）毒理作用机制，多指标结果表明长期低剂量暴露下，主要影响相关通路为凋亡通路、黏着斑通路、小细胞肺癌通路、细胞黏附分子通路，酶活指标和凋亡相关基因指标证实了典型有机磷酸酯显著诱导河蚬细胞凋亡。 关键词：河蚬，miRNA，有机磷酸酯，凋亡通路，生物标志物 ABSTRACT Biological monitoring is an important part of environmental monitoring. Currently the environmental monitoring in China mainly depended on the chemical analysis and monitoring. In recent years, although the internationally biological monitoring technology development is rapid, based on restrictions of our standard of environmental monitoring, the development of biological monitoring in our country has been in the research stage. Currently, biological monitoring manly relies on algae, Daphnia and fish aquatic species, for large benthic current monitoring depends only on biodiversity survey. Therefore, it is urgent to develop aquatic laboratory animals in our country, particularly to strengthen the screening of large benthic biomarkers and modeling study. Therefore in this study the widespread mollusk-Corbicula fluminea in our country was taken as an experimental organism, to strengthen the biological background research, we systematically study biomarkers of the Corbicula fluminea in monitoring environmental pollutants. Finally, we discuss mechanism of environmental pollutants on Corbicula fluminea through the above markers. The main research contents and results are as follows: 1) Through Illumina sequencing we obtained the Corbicula fluminea miRNA biological information, and obtained the
high quality sequences, then identified 45 conservative and 39 new Corbicula fluminea miRNAs; Fluorescence quantitative PCR results showed that nine miRNAs of 12 were expressed highest in the gastropod, while miR-10 and Novel-2 was expressed highest respectively in gi Software prediction results showed that miRNAs related to environmental pollution genes, this provides a molecular biological basis for Corbicula fluminea as an experimental organism. 2) Through RACE technology, we successfully cloned the Corbicula fluminea the full-length cDNA sequence of CCK, Conopression and FFamide, predicted the molecular structure of Corbicula fluminea CCK, Conopression and FFamide protein, and analyzed the distribution of neuropeptide expression in different tissues of C the organic phosphate significantly increased the expression of neuropeptide, indicating that the CCK, and Ffamide Conopression can be taken as Corbicula fluminea biomarkers and this provides a technical means for the biological monitoring of environmental pollutants. 3) By combining with transcriptome sequencing technology and fluorescence quantitative PCR we analysis
the toxicological mechanism of typical organic phosphate(TDCPP and TBP), Multiple indicators showed that long-term low-dose exposure mainly effect apoptosis pathway, focal adhesion pathway, small cell lung cancer pathway and cell adhesion molecular pathways, the detect of caspase enzyme activity and apoptosis related genes confirmed that typical organic phosphate significantly induced Corbicula fluminea cell apoptosis.
Key Words: Corbicula fluminea, miRNA, organophosphates, apoptotic pathways, biomarkers 1.1 生物标志物应用现状 随着人类工业化进程的增加，环境中的污染物越来越多，对人和动植物的健康造成了潜在威胁，大量研究表明，水体中的污染物随着营养能级的提高，难降解、高亲脂性的污染物成百上千倍的在生物体中累积[1, 2]，而作为营养级最高的人类，自然会遭受很大的环境风险，而常规的化学法监测效率低，成本高，监测品种少，难以满足快速增长的污染物品种，因此使用生物作为监测工具，开发相关的生物标志物，对解决当前多门类的环境污染物评估具有重要意义[3, 4]。Goksoyr 等[4]首先定义了生物标志物是生物体暴露在亚致死剂量的环境污染物时，在分子、细胞等水平上发生异常变化的生理生化指标。这些指标通常是生物体早期损伤的预警，开发出相应生物标志物就能为此类环境污染物提供风险评估[5]。水生生物能实时监测水质情况，比传统化学法更加具有优势。我国科学家已经开发出了基于稀有鮈鲫的实时在线监测系统，目前已经广泛的应用到我国水源地监测水质情况，为我们使用安全的饮用水提供了预警，运用了稀有鮈鲫对污染物的敏感特点。 汪纪仓等[6]研究了在镉诱导大鼠肝细胞凋亡中的氧化应激作用，发现醋酸镉通过ROS导致肝细胞凋亡并导致氧化损伤，不是通过caspase途径，ROS才是镉的生物标志物。熊力等[7] 研究五氯酚(PCP)对稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus)胚胎的致畸作用和毒性效应，发现p53基因和CYP1A基因的诱导表达可以作为评价PCP毒性作用的生物标志物。陈辉辉等[8]使用河蚬为受试生物，开发出了氟西汀的相关生物标志物，发现河蚬在氟西汀暴露下，ATP结合转运蛋白基因受到抑制，而且超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛酶活性升高，指示了氟西汀的效应。Cooper等[9]将河蚬暴露在不同浓度毒死蜱下，发现乙酰胆碱酯酶活性是毒死蜱的生物标志物，其活性在高浓度受到明显抑制。相比较而言，河蚬等底栖生物的研究比较少，相关研究也主要是常规标志物，但底栖生物能直接反应水体污染现状，开发我国淡水底栖生物的神经肽类生物标志物并将其运用到环境评价，监测上去具有十分重大的意义。 1.2 microRNA与生物标志物 1.2.1 microRNA背景介绍 MicroRNAs (miRNAs) 是内源性的小无编码RNAs（典型的19到23个核苷酸），通过在转录或后转录水平剪切或抑制翻译动植物mRNAs来调控基因的表达[10]。自从第一个miRNA（lin-4）在线虫中发现以来[11]，大量的miRNAs通过克隆和小RNA测序在不同的物种中被发现[12-16]。目前大约有28645个成熟体miRNAs在223个物种中鉴定出来[17]，人类中发现的miRNAs最多达到1881个前体[18]。在硬骨鱼中总共有1637个成熟体被发现[17]。在软体动物中仅仅发现69个miRNAs[17]，此外，在珍珠贝中发现258个[19]，在牡蛎中发现199个[20]，然而淡水软体动物（如河蚬）还没有miRNAs的相关报道。 近期研究表明miRNAs与器官发育，细胞分化，细胞凋亡有关[21-24].55个miRNAs在牡蛎中被发现可能调控免疫反应[25, 26]。此外。37个栉孔扇贝miRNAs能应答AVNV感染[27]。而且，厚壳玉黍螺胰腺中的miR-29b和腹足中的miR-2a能在自然结冰或缺氧条件下应答[28]。Jiao等[29]通过计算预测方法预测了珍珠贝候选的miRNAs和它们在生物矿化作用中的潜在功能。尽管有计算方法报道过软体动物miRNAs的功能，但淡水软体动物的还不清楚。 Solexa测序是一种测短片段序列的技术[30]，目前已经广泛的在不同物种中用来鉴定保守的和新的miRNAs[31-33]。与传统的miRNAs鉴定方法（计算预测和直接克隆）相比，Solexa测序可以用来发现保守的和低丰度非保守的miRNAs，甚至在没有基因组数据的情况下[34]。 1.2.2 microRNA生物标志物 毒理学研究表明,在环境污染物影响下,生物体相关miRNA表达会发生变化,相应的其靶基因表达也会发生改变。因此在环境毒理学研究中，miRNA可作为识别环境中污染物的生物标记物。王法琦等[35] 使用miRNA芯片技术研究了PFOS暴露下，出生一天和七天大鼠脑组织miRNA表达的变化，结果表明PFOS暴露下出生一天和七天的大鼠脑组织分别有24和17个miRNA表达量发生了显著性差异。通过分析得出PFOS暴露可能对大鼠子代大脑学习记忆能力造成威胁，并且miR-207、miR-297、miR-466b、miR-672和miR-674-3p可能在调控中发挥作用。李鹿丰等[36]研究了在氟虫腈作用下异位表达的miR-155对斑马鱼胚胎细胞ZF4存活的影响，结果表明，72h氟虫腈暴露下，瞬时转染miR-155可以显著降低ZF4细胞的存活率，其潜在靶基因cyb561d2表达显著降低。得出miR-155可作为氟虫腈环境毒性的潜在的生物标志物。Malik等[37]研究了不同剂量苯并芘28天暴露后小鼠肝脏mRNA和miR-34a表达的变化，结果表明50和75 mg/kg/day BaP暴露后miR-34a表达量相对于空白组分别显著性升高了2被和3.6倍，而其他miRNA没有观察到显著性变化，这个miRNA是与P53应答相关联。 目前关于miRNA的毒理学研究主要集中在哺乳动物，而水生动物特别是底栖动物没有相关研究，miRNA背景学资料相当缺乏，底栖生物能直接反应水体污染，其miRNA毒理学研究没有报道，急需进行相关研究。 1.3 转录组测序技术与生物标志物 1.3.1 转录组学概述 转录组是特定发展阶段或生理条件下一个细胞中所有转录本的总和，转录组对了解基因组的功能，揭露细胞和组织的分子成分，了解发育与疾病具有重要意义。转录组学到重要目的在于：记录物种的所有转录本，包括mRNAs，非编码RNAs和小RNAs；决定基因的起始位点，5’和3’转录结构，剪切类型，其他转录后的变化；量化每个转录本在发育或其他不同条件下的表达改变水平。对于非模式生物，因为缺乏相关基因组信息，其遗传育种，生命特征等研究进展缓慢，传统的cDNA克隆，基因芯片技术耗时长，效率低，已经无法满足高速发展的生物信息学技术。 1.3.2 转录组测序技术 随着测序技术的发展，第二代测序技术成为很好解决非模式生物基因信息学的一个工具，与传统基因芯片，克隆技术相比，不用知晓基因片段信息。转录组测序技术检测转录本的精确度达到单核核苷酸水平，不仅可以分析基因表达水平和转录本的序列，而且能检测稀有转录本和未知序列，提供丰富的转录组信息，为我们认识真核生物转录组信息提供了快速，高效，精确的测序技术。目前，已有人类细胞[38]，老鼠[39]，斑马鱼[40]，河蚬[41]，拟南芥[42]，啤酒酵母[43]进行了转录组测序和分析，为在基因水平研究这些物种提供了生物信息学基础。 目前，二代测序平台主要有三个，如ABI公司的(AB SOLiD)、Illumina 公司(Genome Analyzer II) 和Roche 公司(454 GS-FLX)，后来，单分子测序(Single molecule sequencing, SMS)技术由Helicos Biosciences 公司推出。一个重要特点就是高通量，数以千万计的reads被测序。下表列举了这三个平台的异同点。 表1-1 几种测序平台优缺点 测序平台 Illumina/Solexa GA IIx ABI/SOLiD SOLiD3 Roche/454 GS FLX Helicos HeliScope 测序原理 可逆染料终 结合成测序 连接测序 焦磷酸合成 测序 单分子合成 测序 平均读长(bp) 100 35 400～700 21~35 运行时间(d/run) 3~10 7 0.5 5 美元/Mb碱基 0.05 0.15 15 1 主要错误类型 替换 替换 缺失与插入 缺失 准确率 ≧98.5% ≧99.94% ≧99.9% ≧99% 优点 性价比高 准确率最高 运行速度快，读长最长 产量高 缺点 读长短 运行时间长，读长短 错误率高，性价比低 错误率高 本论文以Illumina公司的Hiseq2000测序平台为例，转录组测序技术测序流程主要包括[44, 45]：1、RNA样品准备与质量控制；2、mRNA的纯化与片段化；3、cDNA文库第一链的合成；4、cDNA文库第二链的合成；5、末端修复与加A；6、PCR扩增；7、琼脂糖凝胶的纯化；8、cDNA库的质量控制；9、簇生成；10、上机测序并分析。流程图如下： 图1-1 Illumina Hiseq2000测序平台流程图 转录组测序结果数据量巨大，往往需要使用专业的生物信息学分析，对测序得到的原始 reads（双端序列）进行质量评估和过滤后，将高质量的 reads 进行转录本的组装，对转录本进行结构注释和功能注释。把 clean reads 回帖到参考序列上，再基于回帖结果进行表达量分析、差异表达基因功能注释等高级分析。一般主流的比对数据库有：美国国家生物技术信息中心（National Center of Biotechnology Information, NCBI），欧洲生物信息学研究所（European Bioinformatics Institute, EMBI），COG（Clusters of Orthologous Groups）蛋白数据库，KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes database）数据库。数据分析流程图如下： 图1-2 测序数据分析流程图 1.3.3 转录组测序技术在环境毒理学上的应用 目前在环境毒理学上转录组测序技术有两个方面的主要作用：分子标记物的筛选与鉴定；环境中不同污染物对水生生物的毒理学效应和机制。Huang等[46]分析了全氟辛烷磺酸（PFOS）暴露后的青鳉转录组数据，发现青鳉蛋白和脂肪代谢，线粒体功能和神经系统等通路受到了影响；陈辉辉等[41]在2013年报道了氟西汀暴露后河蚬的转录组数据分析结果，鉴定了9383个差异转录本，发现氟西汀的主要影响河蚬的ABC跨膜蛋白，谷胱甘肽代谢，类固醇合成代谢和细胞自噬作用的通路。总之，转录组测序技术在环境毒理学研究中具有很大优势，不仅可以获取受试生物高通量生物学信息，还能鉴定差异转录本，深入研究环境污染物的毒性效应和机制。 1.4神经肽与生物标志物 1.4.1 神经肽定义，分类与功能 神经肽是一系列不同类的细胞信号分子，由神经元细胞通过调控分泌通路产生和释放[47]。它们在功能上起到神经激素，神经递质和神经调质的作用。作为神经活动的调质，神经肽将神经信号在上下游神经元细胞间传递[48]。神经肽还可以作为激素经由神经器官的网络释放到血淋巴中在调节各种生理状态，包括生长、代谢和繁殖[49]，例如脑啡肽作为神经递质在脑参与外围活动包括免疫细胞功能的调节[50, 51]。 第一个神经肽P物质是在上个世纪早期发现，首先从马的大脑和肠道中粗略的提取出来，并且发现它具有强力的降血压和缓解肌肉收缩的作用[52, 53]。对神经肽严肃而专注的研究已经超过30年，大量的神经肽和它们的家族已经在脊椎和无脊椎动物中鉴定出来，如人，老鼠，猪和章鱼，这些研究对理解它们的功能和特征起到了很大的作用[54]。目前神经肽按家族可以分为：速激肽、下丘脑神经肽、垂体后叶激素、内阿片肽、高血糖素相关肽、神经肽Y记忆家族、内皮素家族、心房肽家族以及铃蟾样肽家族[55]。在无脊椎生物中，许多神经肽也被发掘出来，有抗菌肽、阿片肽、缩胆囊肽等十几个肽家族[47]，而且目前还在不断扩充中，在功能上起到控制生殖，摄食，肌肉收缩，免疫等[50, 56-58]作用。例如FMRF神经肽作为在海蜗牛中发现的最著名的，起到生理上控制鳃的作用[59]，而且通过免疫组化定位与高效液相色谱法发现在心脏组织中存在[60]。在基因组数据的挖掘和神经系统组织肽分析的帮助下，牡蛎的神经肽研究得到了极大提升[61]。 肠促胰酶肽（Cholecystokinin (CCK)）首先被Mutt和Jorpes于1968年发现并命名[62].在脊椎动物中，CCK广泛的分布于脑，据文献报道能减少鸟类，啮齿类动物，猪，羊，非人类灵长类动物以及人的食物摄入[47]。通过调控饱腹感中心来达到调控进食的作用[63, 64]。在软体动物在，CCK可能与一些综合感官功能有关，例如进食相关的行为，在感觉和神经激素间的通信[65-68]. 文献HgCl2可以促进CCK的免疫荧光反应[69, 70]。
Conopressin神经肽，首先在锥形蜗牛的毒液中发现[71]，随后在其他几个无脊椎动物中冶发现，例如牡蛎和蜗牛[56, 72]。文献报道Conopressin与静水椎实螺雄性的交配行为调控有关，在交配期间通过刺激输精管中平滑肌自发性收缩最终导致精子的喷射[73]. 神经肽FF 1985年从牛的大脑中分离出来[74]，是Rfamide肽家族的一员 [57]，而这个神经肽的生物学功能包括痛觉调控，食物摄取，胃肠道和激素的调控，阿片类药物耐受与成瘾和心血管行为的调控[58, 75, 76]。而在软体动物中，文献报道于1995年从静水椎实螺获取FF神经肽的结构是GLTPNMNSLFF-amide，并且该神经肽调控输精管中精子的转移速率[77]。 1.4.1神经肽标志物 Lodhe[70]等使用HgCl2和ZnCl2暴露淡水螺后发现，HgCl2的毒理效应比ZnCl2更加与CCK的行为和免疫反应有关。进一步的实验表明HgCl2能使神经元中粘蛋白含量上升和CCK免疫反应增强，并随着时间推移越来越强[69]。MacDonald[78]等通过给眼斑鳐2周饥饿处理，发现端脑的NPY和肠道中的CCK神经肽基因表达水平升高，但是下丘脑中NPY和CCK表达水平没有受到影响，总之，神经肽在环境毒理学上的应用也非常少，环境污染物对神经肽的干扰效应也未知。淡水双壳软体动物（例如河蚬）的神经肽研究目前也没有报道，急需进行生物标志物的开发。 1.5 有机磷酸酯 1.5.1 有机磷酸酯介绍 自从一些溴代阻燃剂被禁用以来，有机磷酸酯(organophosphorus flame retardants，OPFRs)阻燃剂因其具有良好的阻燃特性，产量大，具有可塑性，易生产，而被广泛的使用，如电子、装饰，化工，纺织等行业，因其是直接混入材料中，有机磷酸酯极易释放到外界环境中，从大气，水体，土地，生物体内都监测到有机磷酸酯的存在，而相关研究表明，有机磷酸酯性质稳定，难以降解，具有环境持久性，毒理学研究表明OPFRs具有明显的致癌性，基因毒性和神经毒性，并能刺激人的皮肤[79-83]。Wang[84]等使用10, 50, 100, 300和600 μg/L TDCPP暴露斑马鱼胚胎，发现暴露引起了体重的减少，孵化率，存活率和心跳速率降低，增加了畸形率，进一步的分子实验表明TDCPP能显著性降低甲状腺激素水平，而增加整体甲腺原氨酸水平，引起了甲状腺内分泌干扰效应。Liu[85]等将斑马鱼暴露在TDCPP和TPP 21天后发现成鱼体中17β雌二醇，卵黄蛋白原水平显著上升，相关的CYP11A，CYP17，GnRH基因表达量都发生改变，得出TDCPP和TPP通过改变下丘脑-垂体-性腺轴调控机制而干扰性激素的平衡，最终达到干扰斑马鱼生殖行为。有机磷酸酯在结构上类似有神经毒性的有机磷农药[86]，而在人居环境中大量存在有机磷酸酯，对人体健康有着潜在的危害。Dishaw[86]等通过在几种典型有机磷酸酯中暴露PC12细胞发现这些OPFRs比四溴联苯醚具有更强的神经毒性。Meeker[87]等初步研究表明有机磷酸酯能影响人激素水平并降低精子活性。 1.5.2 四种有机磷酸酯 磷酸三(2,3-二氯丙基)酯（tris(2,3-dichloropropyl) phosphate，TDCPP），使用量最广泛的有机磷酸酯阻燃剂，据报道在美国TDCPP从1998年的年产量4500吨快速增加到2006年的22700吨[88]，环境中频繁的检测到了TDCPP的存在，如室内空气，灰尘，地表水，饮用水，河流，污水，沉积物和生物群体[88]。例如在地表水，报道TDCPP达到50 ng/L[89]，而更高浓度的TDCPP在德国和挪威的污水处理厂出水中监测到，从20 ng/L到740 ng/L不等[88-90]。而在生物体中，发现TDCPP在鲈鱼体中达到36–140 g/kg脂肪重量[91]。在中国的松花江和太湖的沉积物中都检测到了TDCPP，浓度分分别是2.5-40 ng/L和0.62-5.54 g/kg[92, 93]。而目前关于TDCPP的毒理学机制相关文献报道非常有限。急性毒性结果表明TDCPP毒害作用比其他OPFRs更强，虹鳟96小时半致死浓度是1.1 mg/L[94]，而斑马鱼胚胎116小时半致死浓度是7.0 mg/L[81]。 磷酸三丁酯（Tributyl phosphate，TBP），广泛在核处理，化学工业，防火材料中使用的有机磷酸酯[95, 96]，据报道引起了工人的恶心和头痛[97]，环境中广泛存在，甚至在人血液和牛奶中也有检测到[98, 99]。而在海洋底部以从底泥和碎屑中觅食的底栖生物体内，发现肠道和肉中TBP最高含量分别为230 ng/g湿重和12 ng/g湿重[100]。但是目前人们对TBP的毒理认识还不足。 磷酸三（2-氯乙基）酯（Tris-(2-chloroethyl)-phosphate，TCEP）是一种典型的OPFRs，目前已经被列为痕量污染物名录[101]，在世界范围内广泛的用于液体不饱和聚酯树脂的合成，纺织品背面涂层，PVC，纤维素酯化合物以及涂料[94]。TCEP曾经在1998年产量高达9000吨，但在1997年降至4000吨[101]。然而，TCEP作为一个典型的痕量污染物因为很低的去除率[102, 103]，目前在地表水，污水处理厂出水，海洋和饮用水中浓度从ng/L到μg/L[89, 104]。对TCEP的毒理学研究已经在神经毒性，致畸性，致癌性上有所发现[105-108]。因此环境浓度的TCEP的潜在影响绝大多数还不清楚。 磷酸三（丁氧基乙基）酯（tris(2-butoxyethyl)phosphate, TBEP）也是一种广泛使用的OPFRs，Meyer[102]等通过检测德国某污水厂出水发现TBEP含量为 ng/L，每年全世界的产量为吨[94]。Sager[109]等发现TBEP可能结合β肾上腺素转运蛋白而影响β肾上腺素信号系统的生物学过程。目前对TBEP的毒理学研究非常少。 1.6河蚬的生物学背景及其在环境毒理学研究上的应用 1.6.1 河蚬的生物学背景 河蚬俗称黄蚬、沙喇、沙螺、蟟仔、蝲仔拉丁名（Corbicula fluminea），一种双壳贝类，原产于我国、日本、朝鲜、东南亚各国[110, 111]，隶属软体动物门，瓣鳃纲（Lamellibranchis），真瓣鳃目（Eulamellibranchia），蚬科（Corbiculidae），蚬属（Corbicula）。是我国重要的淡水经济贝类之一，在20世纪初由移民传入欧洲和北美，由于当地淡水环境很适合河蚬生长繁殖，且河蚬因其有双壳严密保护，环境适应能力极强，在当地的河流，湖泊，湿地大量繁殖，已经被欧洲和北美列为外来入侵物种[112-114]。 河蚬喜欢穴居，以水底泥，沙作为理想栖息环境，因生活的底泥颜色差异而形成黄色和黑色，壳硬且厚，长约1.5～2.8cm，呈圆底三角形，壳顶部向外膨胀，壳面泛有紫色光泽，具有类似同心圆的生长轮脉，适宜生长水温为9-32℃[115]，以水中有机碎屑，浮游生物等为食，食性杂，通过鳃滤食食物[116]，是一种底栖生物，目前，在我国淮河，黄河，长江，江苏洪泽湖，洞庭湖等淡水水域，河蚬大量分布，在江浙，广东和福建等地，河蚬被大量养殖。河蚬不仅味道十分鲜美，营养价值很高，而且蚬肉可入药，能明目，通乳，利尿，开胃和解救，对心脏病，肝病，高血压具有显著效果[115, 117]，具有极高的经济价值和药用价值，在海内外特别是韩国日本市场很热销。 1.6.2 河蚬在环境毒理学上的应用 双壳软体动物因其长期生活在水中，活动能力缓慢，捕捞方便，接触水底底泥并对水中污染物具有很强的富集作用，是很理想的水体污染指示生物，一直是环境毒理学研究的实验生物[118-120]，目前以牡蛎，紫贻贝，菲律宾蛤等海洋贝类在环境毒理学中的研究比较多[79, 121, 122]，而淡水贝类特别是我国河蚬的环境毒理应用研究报道比较少。河蚬在我国以及世界淡水环境中分布非常广泛，当前对其的研究主要是繁殖、形态、营养学和少量毒理相关研究。 河蚬作为我国本土淡水双壳贝类，是很好的环境毒理学指示性生物[123]。在我国淡水水域分布极为广泛，数量丰富，容易捕捞，与底泥长期直接接触，可以很直接的反应我国各水体污染状况，而且已经建立实验室驯养和暴露测试体系[8]。先前的研究已经报道过河蚬对水中污染物的高度敏感性[124, 125]。 目前，国内外对河蚬在环境毒理学上的研究主要有以下3个方向：1）河蚬对水体污染物的生物富集效应，Arini[126]等研究了河蚬暴露在Cd，Zn后的回复能力，结果表明一年后仅仅73%的Cd被从河蚬体中排出，而Zn很快就被净化掉。Mark[127]等研究了纺织厂下游河流里河蚬体中的污染物富集情况，发现河蚬体中α-和β-HBCD比沉积物中高。李天云[125]等研究了河蚬对天津排污河道多环芳烃和有机氯农药的富集效应，发现河蚬对有机氯农药的生物-沉积物富集因子为1.79±0.22，而对多环芳烃的富集因子范围是0.021-0.147。以上报道显示了河蚬具有较强的有机物和重金属的生物富集效应。2）对水环境的实时生物监测，目前研究表明河蚬在水体环境恶化时会关闭双壳形成密闭空间来保护自己[128]，这种闭壳保护系统已经运用到污染物的生物监测上，Damien[129]等研究了Cd与河蚬闭壳效应的关系，并在壳上安装电极来实时监测污染状况，Damien[130]等研究河蚬对Cu的闭壳应答关系。3）水中污染物的毒理学研究，国内外研究主要集中在环境污染物对河蚬的毒理效应和毒理机制，评价污染物有微囊藻毒素，有机污染物，内分泌干扰物，重金属，个人护理用品等[8, 9, 131-134]。陈辉辉[123]等研究了卡马西平对河蚬的毒理学机制，发现5和50 μg/L卡马西平暴露后，河蚬Hsp22，Hsp27，Hsp40，Hsp70和Hsp90基因表达量显著性上调，而Hsp60基因表达受到抑制。Aurélie[133]等研究了河蚬对Cu和Cd的早期应答反应，结果表明消化腺中金属硫蛋白基因显著上调，而SOD，CAT，SeGPx和p-GST表达水平降低。 以上研究报道为我们研究水中污染物对河蚬的毒理学效应和机制提供了理论基础和科学依据。 图 1-1 常见双壳类的内部结构示意图（图示为中国蛤蜊） 1.7 实验的目的和意义 目前，国内外已经研究神经肽30多年，在人，老鼠上研究的比较成熟，而在无脊椎动物中的研究也是一直关注的重点，但是大多集中在海洋软体动物和陆生无脊椎动物，没有淡水双壳贝类的相关研究，且环境污染物对神经肽的研究报道非常少。近年来随着溴代阻燃剂的禁用，有机磷酸酯作为一种新型阻燃剂被应用到生活生产的方方面面，而相关文献报道OPFRs对人类健康有潜在的风险，人们对OPFRs的关注度也越来越高，但是对OPFRs的毒理学研究还非常少，对OPFRs的危害评估体系尚不健全。急需建立生态安全评估体系。在生态毒理学受试生物研究上，国内外已经开发了多种受试生物品种，如斑马鱼，大型溞，浮萍，虹鳟，牡蛎，稀有鮈鲫和青鳉等[135-141]，但是关于淡水双壳类底栖生物的报道很少，河蚬作为中国本土的底栖物种，分布广，敏感性强，易取样，能直接反映水污染现状。 本研究通过Illumina测序技术获取河蚬miRNAs信息，为研究miRNA在环境毒理学上的应用提供了基础。利用RACE技术，克隆典型河蚬肠促胰酶肽（Cholecystokinin），Conopressin神经肽和FF神经肽基因，并进一步选取了具有神经毒性的污染物有机磷酸酯，筛查敏感的神经肽标志物，为神经肽的毒理学研究与应用提供了科学依据。使用转录组测序技术评估TDCPP和TBP对河蚬内脏团的毒理机制，为我国对TDCPP和TBP的风险评估提供依据。本论文的技术路线如图1-1。 图1-1 本论文的技术路线
第二章 基于Solexa技术的河蚬保守和新microRNA的鉴定与特征分析 2.1 引言 河蚬作为我国本土淡水贝类是生态毒理学研究的优势物种，陈辉辉等[142]通过转录制测序发现了一些环境标志物基因，如cyp30, hsp70, GABARAP, TPX1, 和SOD。但是目前还没有河蚬环境相关miRNAs的报道。 因此在本研究中，我们使用Solexa测序技术鉴定了河蚬中的miRNAs。此外还使用荧光定量PCR测定了特定miRNA转录本在不同组织中的表达情况，两种法则被用来预测miRNAs的潜在目标，本研究提供了河蚬miRNAs数据，为以后研究河蚬miRNAs的生物学功能和进化提供了技术。 2.2 材料和方法 2.2.1 河蚬的养殖 河蚬取自洪泽湖，养殖方法见附录1 2.2.2 miRNA的提取与测序 首先使用天根miRcute miRNA提取分离试剂盒对河蚬miRNA进行提取，然后在3’和5’接头加上测序序列，接着进行反转，建库，PCR扩增，使用聚丙烯酰胺凝胶分离纯化145-160nt的小RNA，加接头，最后上机测序。提取与测序流程如图2-1。 图2-1 miRNA库建立与测序 2.2.3 miRNA测序数据生物信息学分析 由Solexa测序产生的单个序列通过FASTX工具进行数据过滤，评估序列质量去除低质量序列和3’接头，5’接头和多A序列，计算小RNA长度分布[143, 144]。余下的干净序列使用blast搜索比对到牡蛎基因组上[145]。接着使用BLASTN将有意义的匹配序列比对到Rfam数据库[17]注释rRNA，tRNA，snRNA和其他ncRNA序列。剩下的小RNA比对到miRBase 21中的后生动物成熟miRNAs库。一样或与参考的成熟miRNAs相关的序列被认为是保守miRNAs。没有匹配到任何数据库的序列被比对到牡蛎基因组用来预测新miRNAs。与牡蛎基因组没有任何差别的序列通过MIPEAP折叠来确定为潜在的新miRNAs。使用了如下法则来确定新miRNAs：碱基的数量为18到24，自由能≤-20 kcal/mol，并且miRNA从一个前体端产生。Solexa测序在牡蛎比对中形成miRNA: miRNA*对被认为是miRNA*。 2.2.4 miRNA的鉴定与表达分析 为了鉴定深度测序获取的miRNAs，我们随机选取了8个保守的和4个新的miRNAs，以5S rRNA为内参使用荧光定量PCR分析了他们在四个组织中的表达情况，总RNA使用miRcute miRNA First-strand cDNA Synthesis Kit (TianGen, China)试剂盒来提取，定量液使用miRcute miRNA qPCR Detection Kit (SYBR G TianGen, China)，定量仪使用Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System (Life Technology, USA)，定量引物使用miRprimer软件[146]设计，见表2-1。 表2-1 河蚬miRNA定量使用的引物 miRNA forward primer(5’→ 3’) reverse primer(5’→ 3’) 5s rRNA aagttaagcaacgtcgagccc ttagcccagttgttaccagca cf-miR-1985 cagtgccatttttatcagtcac ggtccagtttttttttttttttacag cf-miR-12 cgcagtgagtattacatcaggt ggtccagtttttttttttttttcagt cf-miR-216a cgcagtaatctcagctggt ggtccagtttttttttttttttcagaa cf-miR-216b cgcagtaatatcagctggt gtccagtttttttttttttttcagga cf-miR-67a gcagacaacctgcttgaatg ggtccagtttttttttttttttcct cf-miR-184 cagtggacggagaactga ccagtttttttttttttttgccctt cf-miR-10 gcagtaccctgtagatccga aggtccagtttttttttttttttacaa cf-novel-14 tggcactggcggaa ggtccagtttttttttttttttgtga cf-novel-2 cagacactgcgatctattgag gtccagtttttttttttttttcttagtc cf-novel-18 tgccctatccgtcagtc gtccagtttttttttttttttgcag cf-novel-31 gagctgcctgatgaagag tccagtttttttttttttttggaca 2.2.5 目的基因预测分析 John等[147]报道过的目的基因预测方法。尽管河蚬基因组和EST序列缺乏，但是有4个环境相关的基因全长(gst-pi, hsp70, cyp4 and metallothionein)可以从ncbi上获得，使用miRanda [148]和RNAhybrid [149]对miRNAs和这四个基因的3’非翻译区作了目标预测。 2.3 结果与分析 2.3.1 miRNA序列分析 我们使用河蚬外套膜，肌肉，消化腺，性腺和鳃的RNA样品建立了一个小RNA库用来获取河蚬的miRNAs信息。过滤掉低质量的和接头序列，清楚污染的和短序列后，我们获得了28,799,934条高质量的reads。这些干净序列然后被映射到牡蛎基因组。得到了代表39813个序列的6194289个高质量reads（表2-2）。去除掉rRNA, tRNA, snoRNA和其他ncRNA序列，剩下的4995304 reads（代表16144个 不同的reads）被用来预测保守的和潜在的新miRNAs（表2-2）。不同类型的小RNAs的数量和比例如表2-2。 尺寸是一个重要的特征用来区分miRNAs和其他小RNA[150]。miRNAs的尺寸一般是18到24bp[151]。本次研究的小RNAs的尺寸分布如图2-1。我们发现绝大多数是22bp，占了总reads数的14.4%。同样地，在斑点叉尾（25.8%）[143]和珍珠贝中（34.48%）[29]也是22bp的最多。 图2-1 高质量reads长度分布 表2-2 河蚬中不同类型小RNAs长度分布 Small RNA Unique RNAs Percent (%) Total RNAs Percent (%) Total 39,813 100 6,194,289 100 rRNA 11,262 28.29 1,048,538 16.93 tRNA 2,124 5.33 22,289 0.36 snoRNA 19 0.05 183 0.00 other 10,264 25.78 127,975 2.07 miRNA 16,144 40.55 4,995,304 80.64 2.3.2 河蚬保守miRNAs确定 为了确定河蚬保守的miRNAs，我们将测序数据比对到在miRBase 21中的后生动物miRNAs库，允许有1到2个错配碱基[152]。总共16144个唯一的序列}