做蛋白纯化时,蛋白的PI是9.12 怎么配制binding buffer 和Elution buffer,我见到的缓冲液
做蛋白纯化时,蛋白的PI是9.12 怎么配制binding buffer 和Elution buffer,我见到的缓冲液最大是8
建议换用碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液代替pbs,觉得一些实验书里应该会有这个的配方的.
与《做蛋白纯化时,蛋白的PI是9.12 怎么配制binding buffer 和Elution buffer,我见到的缓冲液》相关的作业问题
.等待高人回答txstbbm(站内联系TA)可能情况：1,ORF不完整或者不是预期的ORF,His没表达出来2,His被空间结构所掩盖,建议变性后再过柱cloudy3197(站内联系TA)同一ls,可能跟蛋白空间结构有关,变性后再上柱.2.柱子是新的还是以前用过的,旧的应该很好的处理一下,3.缓冲液很重要,蛋白与柱子结
取决于蛋白降解的程度,如果不完全降解,出来的条带肯定会很暗；如果完全降解了,根本就没条带
mbp前面都会带有一个his标签 其实是用his纯化的 再问： ?????????????????????30?γ?????????????20?????????????????????? 再答： ???????????20s???????再问： ???15???30?Σ??????????????
有his标签么?要不就是beads的事?是你自己装的柱么?多长时间了?还有可能是你的蛋白构象变了,可能把his部分裹在里边了,找找别的条件,或者换NC端.
一般用细砂糖,都会融化的.
这要综合考虑蛋白样品的纯度,蛋白样品的浓度.一般保证每个泳道上样的蛋白总量在5微克到10微克左右跑出来比较好看.考虑到泳道上样最大体积可能是20微升也有可能是15微升,所以蛋白浓度要根据上样的蛋白总量除以上样体积得出的蛋白浓度来考虑是否稀释.
lysis buffer中加咪唑的目的是与杂蛋白竞争,使那些与填料亲和力弱的杂蛋白不能挂柱；wash buffer中加咪唑是为了洗去大部分已挂柱的杂蛋白（也会洗去少量目的蛋白）；elution buffer中加梯度咪唑,而且咪唑浓度渐高,是咪唑和目的蛋白竞争性结合填料,从而把目的蛋白从柱上洗脱.这是我的理解,欢迎继续讨
可能是表达的问题.在表达你目的蛋白的同时有很多杂蛋白被同时表达了.你可以增加前面洗脱的步骤,尽可能多的将杂蛋白洗脱掉.
72/12*21=126 再问： *是什么意思？ 再答： 乘号
由于直导线ab匀速运动，则ab切割磁场产生的电流时恒定的，线圈产生的磁通量也是恒定的，所以不会引起副线圈的磁通量的变化，所以副线圈不会有感应电流产生，即安培表A2的读数为0．故选：C
纯化过程中的沉淀可有以下原因：1.蛋白本身容易絮凝,如果是这样,可添加Tween-20减少具体产生.2.pH靠近蛋白的等电点,可根据软件计算入VECTOR NTI计算其理论等电点,尽量纯化的溶剂在远离等电点.3.蛋白浓度过大,调节纯化时蛋白的浓度即可,如果需要高浓度蛋白,用超滤或冷冻干燥浓缩即可.4.离子强度,你已经试
第一次距离第十一次5*10=50个小时,这50个小时里面,有4个12小时+单独2小时,常识得知,当指针指向一个地方的时候,在过12个小时指针则会在相同的位置.所以,往前推这50个小时,实际是等价于往前推2个小时,所以4-2.
G-25就是一种经常用来除盐的填料啊.但是一般用来除盐的凝胶分离的分子量都偏小,且柱子偏粗,达不到分子筛的合适径高比.用来做蛋白纯化要达到目的蛋白与其他蛋白的分离目的不合适.用的较多的是S-100、200.
DTT不是上样的时候才加,可以在配制loadingbuffer 的时候事先加好.你看看DTT的分子量,再算下该加多少克~
标准品就是纯的那个蛋白 用来做一个不同浓度梯度下的标准品曲线 这样你测出来的吸光度再对照标准品曲线去换算浓度是多少
Ni离子是重金属,进入蛋白中肯定是有影响的,如果这个蛋白是用于人体或者动植物的肯定是不行的.Ni柱重新挂Ni确实是必须要脱Ni的,但一般是先用咪唑把蛋白全部洗下来后才脱Ni的,所以一般不太可能进入蛋白溶液中,如果进入了你可以重新用另一根柱子（这个柱子得保证结合你的蛋白）,将蛋白溶液穿过这个柱子,让蛋白结合至柱子上,而N
首先,考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时,准确度是由一定范围的,浓度超出范围肯定不准.另外,你在8ug/ml时的收率74%是否稀释测定?最后,高浓度和低浓度回收效率也是有一定范围的,低了高了都不好,最佳回收效率也是在适当浓度下,如果你有兴趣可以做一下梯度实验来证实我的判定.希望能给您帮助. 再问： 嗯，考马斯亮兰法的微量测定
其实蛋糕也要分很多种,有些蛋糕是靠蛋白的打发气泡来使蛋糕膨胀松软,有些是靠泡打粉（一般重奶油蛋糕就不需打发蛋）.所以要看你是做的那种蛋糕.两者是不能替代的.蛋白打发是需要一些注意事项的.1.蛋白要新鲜,打发前可将蛋白放在冰箱冷藏室冷却一会,这样比较容易打发.2.装蛋白的盆子和打蛋器,必须保证无油无水气,不然蛋白是打发不
只看marker也不可靠吧?还是用ponseau S （丽春红）给膜上的蛋白质显色看一下到底如何.另外膜上没有marker的话,胶上还看得到marker吗?如果还在胶上,那么蛋白质可能也还在胶上,可以改变电流和时间重做一遍.如果胶上膜上都没有,那搞不好就跟二楼说的一样,正负极接反,样品全跑到缓冲液里去了.蛋白加loading buffer煮过后如何保存 - 实验交流 - 生物秀
标题: 蛋白加loading buffer煮过后如何保存
摘要: [蛋白加loading buffer煮过后如何保存] 能否放在室温？反复冻融可不可以？每次上样前还要煮吗？ 关键词:[反复冻融]……
能否放在室温？反复冻融可不可以？每次上样前还要煮吗？
放－20度，一个星期内稳定。
一年都稳定
能不能放4度啊，我用一个月，经常用。
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loading buffer的成分及作用
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标题: 请问跑SDS-PAGE时，loading buffer什么时间加入好？
摘要: [请问跑SDS-PAGE时，loading buffer什么时间加入好？] 1 请问跑SDS-PAGE时，loading buffer什么时间加入好？是先和蛋白样品混合后再加热上样？还是蛋白样品先单独加热变性后再加入loading buffer上样？2 顺便问一下5%的浓缩胶和12%的分离胶在室温下多久凝聚是正常的？请各位多多指教！ 关键词:[SDS-PAGE 浓缩胶 等体积 分离胶 蛋白质 蛋白浓度 蛋白样品 复合物]……
1.请问跑SDS-PAGE时，loading buffer什么时间加入好？是先和蛋白样品混合后再加热上样？还是蛋白样品先单独加热变性后再加入loading buffer上样？
2.顺便问一下5%的浓缩胶和12%的分离胶在室温下多久凝聚是正常的？
请各位多多指教！回复
1.loading buffer应该在加样前与蛋白等体积混匀,然后煮样5分钟,先单独加热变性蛋白样品后再加入loading buffer上样是错误的操作方法
2. 5%的浓缩胶和12%的分离胶在室温下十几分钟到半小时内凝固都是正常的,冬天半小时后凝固也是正常的
请教，loading buffer与蛋白等体积混匀吗？好像是按蛋白与SDS的比值来加的吧。
不一定是等体积混合，他说的那种是预先配制的2× buffer，这种就是一份样品加一份buffer，有1×，4×等多种配制浓度，不同浓度添加比例都不一致，最终使你的混合液变成1×就对了。
buffer、样品溶液是混合后再加热的，这是使SDS和蛋白质充分结合形成复合物的一个过程，且SDS相对蛋白质必需过量添加，结合不充分会对后面结果造成干扰。
楼上的解释很合理哈，那如果样品浓度很低，而梳孔的上样量有限，可不可以不稀释成1×的呢，以保证SDS过量？
1×一般用于直接添加干粉样品，为了保证电泳的检测灵敏度想增加样品上样量，那可以选择4×的（同样上样量可以加3份样品，1份buffer，那么样品上样量就提高了）。但如果样品浓度过低也就没意义了，杂蛋白都不能检出（药典上对上样量是有要求的）浓度不足的话，得想办法把样品浓缩再检测。可控制蛋白浓度以保证SDS过量，SDS一般是高于蛋白质量的3～4倍就可以了。
等体积好像不是很好把，我一般是1：4，不过我的1× buffer的
最好估计蛋白质的ug数，以便个上样孔蛋白质等量。1XBUFFER 对各孔一样等体积加入， 再煮沸2-3分钟，冷却3分钟，加人样品孔。
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等体积好像不是很好把，我一般是1：4，不过我的1× buffer的
蛋白浓度低要用高浓度的buffer，比如5X的
样品少可以用2X的，这样在煮样时就可以防止煮干或挂壁损失
蛋白浓度低要用高浓度的buffer，比如5X的
样品少可以用2X的，这样在煮样时就可以防止煮干或挂壁损失 样品少可以用2X的，这样在煮样时就可以防止煮干或挂壁损失
样品加入eppendorf 管，盖好并用特制的盖夹固定，煮1-3分钟，不用担心煮干或挂壁损失，由于1XBUFF 含有蔗糖等物质。
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样品少可以用2X的，这样在煮样时就可以防止
煮沸之前加loading buffer, 我们用4×的，加的量是样品量的1/3，涡旋混匀，然后封口胶封好，放入固定板中，沸水中煮3min就可以了。封口胶封住后不用担心水蒸气进去。之前说的固定板，其实很简单，就用泡沫塑料什么的弄几个洞，把EP管插进去就行了。另外，一个很简单的思路，关于loading buffer先加还是后加的问题，如果后加，buffer还有什么用呢，蛋白加热煮沸，不就和煮鸡蛋一样了吗，呵呵，这是我原来犯过的错误Smile
12%的分离胶，因气温的不同凝胶时间不同，有一个简单的方法，正丁纯封胶后，如果分离胶凝固好了，会在胶与正丁纯间有一明显的介面。
5％浓缩胶，比分离胶时间要快，可以根据剩下的浓缩胶来看，观查烧杯中浓缩胶是否凝固，以判断，就是说如果烧杯中的浓缩胶凝固好了，那么制胶也就可以了。
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