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Q1：RNase 是RNA制备的杀手A1：在所有RNA实验中，最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定，一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解，而所制备的 RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA分析的结果，所以RNA的制备与分析操作难度极大。& & 在实验中，一方面要严格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。防止RNA酶污染的措施1.&
所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。2.&
塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿冲洗（注意：有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀，故不能使用）。3.&
有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室温10min，然后用0.1% DEPC水冲洗，晾干。4.&
配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC，在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经0.22μm滤膜过滤除菌。5.&
操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.&
设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。常用的RNA酶抑制剂1.& 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。2.& 异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。3.& 氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。4.& RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。5.& 其它：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。Q2：无RNA沉淀A2: 原因可能如下：1. 匀浆不完全：匀浆不完全时，基因组DNA分子仍然很大，溶液粘稠。变性的蛋白质和基因组DNA一起形成絮状凝集物容易包裹RNA，使之不能有效地释放到溶液中。2..沉淀不完全：从小于2×105动/植物细胞、小于2mg动物组织、小于4mg植物组织或RNA含量低的动/植物组织中提取RNA时，匀浆体积太大，将造成RNA过分稀释而不能沉淀下来。当从这样的样品中提取RNA时，应按比例减少抽提溶液。Q3：抽提率低A3：原因可能如下：1.系统超负荷：如果过多增加单位体积内的样品量，将引起系统超负荷。系统超负荷常导致匀浆不完全、单位体积内的DNA和蛋白质所占比例增大，使RNA不能有效地释放到上清中。系统超负荷还会导致相分离困难，降低RNA沉淀效率。2.样品均化或裂解不完全: 匀浆不完全时，RNA分子易被蛋白质和基因组DNA复合物包裹，不能被有效释放。3.终RNA不完全溶解:未溶解的RNA丢失。4.样品未及时处理或细胞生长过度：样品分离后短时间内细胞内RNA酶被激活，细胞生长过度同样会激活细胞内RNA酶，若不及时提取RNA，大部分RNA会被降解。若样品暂时不作RNA提取，应立即用液氮冷冻完全，置-80℃贮存。Q4:如何判定分离的总RNA的纯度A4:需要从两个方面着手，缺一不可，特别是新手（1）测定OD260/OD280的比值，测定时，RNA需要用10mM Tris-HCl,pH7.5稀释。理想的RNA, OD260/280在1.9-2.1之间。比值如果过低，可能有蛋白质污染，过高RNA可能已发生降解。（2）琼脂糖变性电泳观察rRNA的完整性和强度。变性电泳需要采用MOPS系统，不可以采用DNA 电泳用的TBE或TAE系统。如果OD260/OD280过低（&1.7），通常可以通过减少组织和细胞的用量来实现。Q5：如何除去纯化的RNA中微量的基因组DNAA5：无论用种方式制备的总RNA,要绝对保证不含基因组DNA是不现实的。如果您希望得到DNA free 的RNA样品，需要用RNase free的DNase I处理。Q6：纯化的RNA样品如何保存？A6：如果希望得到最佳的结果，纯化的RNA需要立即用于下游实验。RNA可以保存在-80C冰箱，长期保存可以置于液氮中。如果没有-80冰箱或液氮，RNA也可以保存在异丙醇或乙醇中，-20度保存。Q7： RNA降解原因 A7：原因可能如下：1. 新鲜细胞：如果没有问题，且外源性污染也可以排除，那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如 果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞，一定要使裂解液能覆盖住细胞。2. 新鲜组织：某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏，胸腺等)，即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是：在液氮条件下将组织研碎，并且匀浆时使用更多裂解液。3. 冷冻样品：样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品，即使是冷冻细胞，如果不在液氮条件下研磨碎，而直接加入裂解液中匀浆，RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化，所以研磨用具必须预冷，在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。4. 外源RNA酶的污染：，器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。5. 内源RNA酶的污染：抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多；匀浆时温度过高。& & 试验中我使用的总RNA抽提试剂为SunShineBio总RNA提取试剂,是生兴生物有限公司提供的，该试剂是一种广谱型总RNA抽提试剂，可在1小时内从动植物组织、微生物、培养细胞等各类样品中抽提总RNA。该试剂能充分裂解样品，并有效抑制细胞内核酶活性，保证了所提取总RNA的纯度及完整性。
生兴生物 最后编辑于
RNA提取的流毒非浅的经典误区（RNA提取的实践指南）最近碰到了好几个RNA提取的初学者来实验室学习如何提取RNA，对于如此简单的操作，却有如此多的人提取不出来，细问一下，原来他们的知识来源都是书本上或者网上的“RNA提取注意事项一类”的所谓经验，其实，他们提取不出来的真正原因，恰恰是他们严格遵守了所谓的经验，精力全放在不需要注意的地方，结果搞得自己很紧张， 真正需要注意的操作反而没有注意了。下面我就结合网上常见的RNA 操作注意事项与实验技巧的文章指出提取RNA的流毒非浅的常见误区：1．“ 如果可能，实验室应辟出专门RNA操作区，离心机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保持清洁，并定期进行消毒。”完全错误，任何普通的试验台，不需要任何消毒，暴露在空气中就可以。用我的话说就是垃圾堆里面我都可以提取出RNA!有的学生告诉我他们在哪里提取的， 他们在超净台里面操作，只有两个孔伸手进去，操作及其不便，还容易使人疲劳，风干RNA沉淀的时候，也看不清楚，常常造成要么干过头，要么乙醇残留高。空气中有RNA酶污染，还到处乱飘，还会到离心管子里面降解RNA,谁告诉你的？你看见了？你做过实验了？人家说啥你就信？如果真是这样空气到处飘RNA酶，你的电泳槽，电泳仪，电泳液总不可能放到超净台电泳吧？你配制电泳缓冲液总不能不暴露在空气中吧？电泳液体，电泳槽不知道早就被飘进多少RNA酶了，那还怎么跑电泳，全部降解！可能嘛？更何况超净台空气净化过滤的是细菌大东西，RNA酶蛋白分子那么小它能过滤得掉嘛，所以如果空气中有RNA酶，超净台也挡不住的。稍微分析一下就明白了。实际上，随便啥普通实验室的试验台提取RNA，几百次了，从未因为没有在超净台提取就降解RNA的。2．“操作过程中应自始至终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套，并经常更换，以避免将手、臂上的细菌和真菌以及人体自身分泌的RNA酶带入试管或污染用具。尽量避免使用抛弃式塑料手套。塑料手套不贴身，常常造成操作不便，而且多出部分还容易在器具上遭RNA酶污染并向未污染处传递，扩大污染。”这是流传最广的错误，因为手上的RNA酶，按照正常的操作，怎么可能带到离心管里面？即使沾到离心管壁外面了，对里面的RNA也完全没有影响啊。难道你是崂山道士，不带手套抓住离心管子，手上RNA酶可以透过塑料管穿墙过去降解RNA?如果你有这个本事，塑料管子都可以穿透，再戴个手套那不也可以穿透？穿2条裤子放屁和穿一条裤子放屁一样挡不住污染大气-多此一举。如果说你不戴手套，你手上的RNA酶多到可以随时掉下来，掉渣，掉到离心管子里面。那不是提取RNA的问题，那是卫生问题，你该洗手或者洗澡了。除非有人参观，我一般提取RNA根本不注意是否带了手套，戴手套也是为了保护手不沾到苯酚，氯仿。 而不是怕污染。至于扩大污染一说， 完全是胡扯，试验台上早就到处是飞沫，手接触后留下的RNA酶，早就污染完全了，再说，还是我刚才说的，它们怎么可能转到小离心管里面？3．“研钵去干烤”。不需要，洗干净，晾干就可以了，即使里面有一些RNA酶残留，有液氮的时候如此低的温度下怎么可能降解RNA，转到裂解液后，外源，内源的RNA酶就会被全部抑制。何况，组织里面那么多的内源性RNA酶研磨的时候都不会降解RNA，残留一点在研钵上的RNA酶就会吗？实际操作，研钵洗干净（避免交叉污染就行），然后晾干，或者用纸擦干就直接用了。残留一点不会影响。4．“操作时候戴口罩，帽子，不说话”。不需要， 除非你提取的时候唾沫横飞， 而且特别准确，有一滴飞入了你手上拿的1.5毫升的离心管。总之，我边提取的时候， 边要和学生大谈，提取RNA如何如何的简单。5．“用DEPC处理枪头， 小离心管”。不需要，国外的枪头，离心管散装的，装好在枪头盒里面 ，直接可以用，不需要高压灭菌。国产的我用得不多， 反正我买过浙江产的2分钱一个的离心管，照样不需要DEPC处理，不需要高压，打开了，直接用。总之做不出来， 首先千万不要找枪头，离心管是国产质量不好的原因。道理很简单，高温高压生产线的塑料管子早就经历了几百度高温的融浆状态，早就RNA酶灭活干净了。退一万步，即使污染了RNA酶，至少和裂解液接触的枪头离心管子全部不用处理吧？。举个例子，如果用一个污染了RNA酶的枪头去吸取裂解液，会发生下面哪种情况：1.枪头把RNA提取裂解液污染了。2.裂解液把枪头RNA酶给灭活了。想想内源性提取的细胞的那么多RNA都可以被裂解液灭活好好的。枪头一点污染能不灭活？大家想一下， 当大家经过了网上如此繁琐的错误的注意事项洗礼的时候，他还能有精力去注意提取RNA的重点和真正应该注意的东西在什么地方吗？其实，真正应该注意的就是。。。。。。，我累了，下次说。北京艾德莱生物张老师，RNA提取专家欢迎和大家的交流。qq:
北京艾德莱生物RNA提取产品选择指南首先询问客户提取的大致种类，是动物组织细胞？植物？血液样品？真菌？细菌？病毒？酵母？不同的种类应该选择不同的产品。动物组织细胞 (1)RN01 TRIpure reagent,这个就是Invitrogen的TRIzol，我们质量完全和进口一样可以100%替代进口TRIzol。 (2)RN04 总RNA提取试剂盒。这款就是TRIzol，只是把TRIzol配套使用的氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC处理的水和配全了。等于是TRIpure（RN01）加氯仿，异丙醇，70%乙醇，DEPC处理的水。 (3)RN03 RNApure 超纯总RNA快速提取试剂盒。这个等于是TRIzol加离心柱子，在TRIzol的基础上加了离心柱子，速度更快，纯度更高，操作更简单。等于是TRIpure（RN01）加离心柱子。 (4)RN07 EASYspin组织/细胞RNA快速提取试剂盒。这款等于是Qiagen的74104完全一样，它的优点在于不用苯酚，氯仿等毒性物质，速度最快，但是残留DNA可能稍多，必要时候还可能要用DNA酶消化。 (5)RN28 EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒。这款等于是Qiagen的74134完全一样，是目前世界上最先进的试剂盒。15分钟提取，不用苯酚，氯仿，也不残留DNA，不用DNA酶消化直接可以做荧光定量PCR，唯一缺点，就是好货不算便宜。总结：首先推荐就是RN03 RNApure 超纯总RNA快速提取试剂盒或者RN28 EASYspin Plus组织/细胞RNA快速提取试剂盒这两款产品。其它的随机应变。根据客户需要来，客户觉得RN28贵，就推RN03,还觉得贵，就推RN01,就是想替换invitrogen的TRIzol,就推RN01，还想TRIzol的基础上用离心柱子，更快更好，就推RN03,想替换Qiagen的74104，就推RN07，也可以建议我们有升级版本的Qiagen的74104，就是等于Qiagen的74134的更好的RN28，如果嫌RN28贵，就还是用RN07替换74104,但是一般能用Qiagen的客户，肯定能用得起更好的，就推荐RN28,这款等于Qiagen的74134，是目前最好的。 植物植物千变万化，种类繁多，非常复杂，世界上任何一家公司任何一种试剂盒也无法确保100%提取成功。因此选择推荐植物RNA提取试剂盒必须多和客户，技术人员沟通。 A: TRIzol可以提取的植物样品首先询问客户的样品是否曾经用别的试剂或者试剂盒提取过的植物样品，TRIzol是否可以提取成功？如果TRIzol可以提取成功的样品： (1)首先有两种选择：第一是用我们的RN01 TRIpure reagent,这个就是Invitrogen的TRIzol，我们质量完全和进口一样可以100%替代进口TRIzol。 第二是用RN33 PLANTpure 通用植物总RNA快速提取试剂盒 （普通植物组织细胞）,这个试剂盒的原理，成分和RN03完全一样，也是TRIzol加离心柱子，在TRIzol的基础上加了离心柱子，速度更快，纯度更高，操作更简单。等于是TRIpure（RN01）加离心柱子。 (2)然后根据客户的特殊具体需求比如想速度更快，操作更简单，还不想用TRIzol这种苯酚，氯仿毒性物质的客户还有两种选择：一种选择是RN09 EASYspin植物RNA提取试剂盒，这个盒子和Qiagen的74904完全一样，不用苯酚，氯仿，速度最快，操作最简单。但是对部分植物样品来说，可能残留基因组DNA稍多，只有做了试验才知道客户的样品是不是残留DNA稍多，就是Qiagen也不能确保100%的样品没有残留DNA。我们能确保的就是和Qiagen的效果一致。实在有DNA残留的，就可能还要用DNA酶消化。具体只能让客户自己权衡选择或者和艾德莱技术人员沟通了再选择。另一种就是RN38 EASYspin Plus植物RNA提取试剂盒这个试剂盒是RN09的改进版本（Qiagen也没有这款，是艾德莱在Qiagen基础上改进世界首创的），它使用基因组清除柱子的技术和配方在保持RN09不用苯酚，氯仿毒性物质，最简单，最快速的基础上消除了基因组DNA残留，一般肉眼不可见DNA残留。注意：目前在我们测试的几种植物样品中均已经获得成功，使用RN09提取有残留DNA的样品种类使用这款后，均无DNA残留。但是，植物千变万化，我们还是不能给客户做100%保证（世界上也没有公司可以保证，我们已经是最好的）。让客户自己权衡或者找艾德莱技术支持沟通后再选择。 B: TRIzol无法提取的植物样品如果客户说，他们曾经用过TRIzol，但是TRIzol无法提取成功，或者没有用过TRIzol，但是知道TRIzol无法提取成功的样品，那么RN01,和RN33是肯定不行了。别无选择只有两个可能推荐：RN09和RN38,具体又分两种情况： (1)叶片、花瓣、花芽类比较叶片类的种类包括象葡萄叶子，杨树叶子类代谢产物多酚丰富的种类：叶片、花瓣类目前成功率基本为100%，这种情况推荐RN09，或者RN38都可以。客户特别在意不要有DNA污染，用于做反转录荧光定量的可以推荐RN38尝试。 (2)如稻谷种子，百合鳞茎，葡萄果实，唐菖蒲的球茎等淀粉含量特别大，特别干种子一类：这一类很难提取，失败率高我们不能确保成功，只能客户根据需要尝试，不能确保成功。必须找艾德莱技术支持沟通再选择。总结：植物千变万化，如果TRIzol可以提取的种类，我们100%的确保我们RN01和RN33一定可以提取。想要更快速简单，无毒性物质的，可以尝试RN09和RN38。但是如果碰到TRIzol不能提取的种类，只能尝试RN09和RN38，我们绝对不能告诉客户100%能成功。尤其是淀粉含量特别丰富的土豆，块茎，稻谷种子，干种子之类的样品，失败率还是很高的。必须多和艾德莱技术人员沟通。我们能100%保证的就是RN09和RN38，一定只比Qiagen的同类产品74904好，Qiagen的74904能提取出来的样品种类，我们不能提取的，退货再赔偿1000元。这个可以和客户保证。（这还是我们保守的说法，因为象Qiagen 74904不能提取的冬青树，虎仗，黑加仑很多样品，我们RN09，RN38都可以提取,实际上RN09就是改进版的Qiagen的74904）客户部分成功样品列表（还在不断增长中）：棉花、海棠、黑加仑、烟草、拟南芥、虎杖、大豆、草莓、冬青、月季、蔷薇、沙棘、冬枣、芦荟、仙人掌、报春花、水稻、玉米、唐菖蒲、樱桃、白玉兰、毛白杨、樱花、葡萄、百合花、紫菜、绿藻、香蕉、水仙花、青花菜、地被菊、苹果、梅花、番茄、石斛、毛桃、苎麻、榛子。真菌样品选择是RN09 EASYspin植物RNA提取试剂盒，没错，真菌就是用RN09植物RNA提取的盒子来提取的。这个盒子RN09和Qiagen的74904 RNeasy plant mini kit完全一样。客户要搞不清楚就下原版qiagen的说明书看看就行了，确保RN09和Qiagen的74904一样。下面是Qiagen网站的74904的介绍:
RNeasy Plant Mini Kit 从植物和真菌中纯化多达100 ug总RNA 30分钟即可获得高品质的总RNA 无需酚/氯仿抽提无需氯化铯梯度离心，无需氯化锂或乙醇沉淀出色的RNA回收率即用型RNA适合各种下游应用血液样品 A: 无保护直接冻存血液（血液RNA保存的时候，一定要先处理了才保存，直接把抗凝血液冻到负80冰箱，RNA肯定降解，至少部分降解。）提取冻存的血液RNA的时候，你没有太多选择，只有选择RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒，因为你不可以先融解冻血，然后再裂解红细胞，因为细胞冰冻后已经受损破裂，RNA酶释放出来了，这个时候，不能裂解红细胞再去折腾了，必须使用可以直接裂解全血的裂解液，乘RNA酶还没有完全降解RNA的时候，就抑制住RNA酶，然后往下面提取。 B: 新鲜的血液 (3)可以选择RN25 RNAblood 超纯全血总RNA快速提取试剂盒,这个原理就是先红细胞裂解液裂解红细胞得到白细胞，然后Trizol(TRIpure)裂解白细胞，最后离心柱子漂洗。 (4)也可以用RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒。 (5)RN06 EASYspin 全血RNA快速提取，这款和Qiagen的qiaamp blood RNA KIT一样，优点是不用苯酚，氯仿（trizol）毒性物质。缺点是残留DNA多，还要加DNA酶消化，如果RNA做荧光定量PCR，不推荐这款。 (6)最后，你经费特别紧张，也可以选择RN23的不用离心柱的版本。RN02 TRIpure LS Reagent，LS就是liquid sample的意思，液体样品RNA提取试剂，就是专门提取液体样品的TRIzol版本。这个缺点就是不用离心柱子纯度差一点（当然一般不影响试验结果），繁琐一点，对操作技术的要求高一点，样品量太小也不适合。总结：如果是新鲜血样品，首先推荐RN25 RNAblood 超纯全血总RNA快速提取试剂盒或者RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒；如果你是冰冻血，别无选择，只有推荐RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒；需要处理，运输，保存血液样品后再提取也是推荐RN23 RNAliquid 超速全血（液体样本）总RNA提取试剂盒。
酵母样品 RN10 EASYspin酵母RNA快速提取试剂盒，不用苯酚，氯仿毒性物质，快速简单。细菌样品 RN08 EASYspin酵母RNA快速提取试剂盒，不用苯酚，氯仿毒性物质，快速简单。从同一个样品里面同时提取RNA、DNA 病毒样品（从血浆，血清，体液等无细胞体系） RN27 病毒RNA快速提取试剂盒 RN29 ALLprep 组织细胞RNA/DNA分提试剂盒。这个等于是Qiagen的80204 AllPrep DNA/RNA Mini Kit完全一样。从同一个样品里面同时提取RNA、DNA、protein蛋白 RN36 ALLprep 组织细胞RNA/DNA/Protein分提试剂盒。这个等于是Qiagen的80004 AllPrep DNA/RNA/protein Mini Kit完全一样。总结：任何从一个样品里面同时提取RNA,DNA，蛋白或者任意组合的客户都可以做。扫二维码下载作业帮
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rna提取降解问题我提的RNA28S没有18S亮,但是条带很清晰,没有拖带现象,OD值也较高,这种情况是不是降解呢?
未来大空櫴
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这不算降解.没关系,可以用.
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提取组织RNA时,如何减少RNA的降解!
无限出品0455
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1：所有用到的枪头、离心管都要在0.1%的DEPC水里浸泡过夜够,灭菌烘干使用.当然这些耗材都有现成商业化的买.2：所有实验中用到水的地方都是0.1%的DEPC水（灭菌失活）.3：液氮研磨,裂解时间不宜太长,需要纯化的,粗提出的RNA尽快纯化,不要放太长时间.4：去NDA时,DNA酶处理的时间要短,不超过30分钟.5：尽量在低温的条件下操作.戴口罩,在冰上操作时注意不要有水碰到管口.自来水,人说话时的口气,唾沫都会污染RNA.
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1. 迅速操作2. 一次性用具3. 防止RNA酶污染（尤其是手上）4. 样本用RNALater浸泡
主要是令人头疼的RNase，皮肤、头发、唾液甚至是受可能触及的仪器开关、移液器、冰箱把手上等等...而且他耐受高温等极端条件，在最适条件下恢复活力因此所有试剂、耗材如枪头、试管要经DEPC水处理，单独存放；多换手套，实验中尽量少触碰其他东西；最好戴口罩、发套、白大褂，尽量避免走动和交谈；尽量单独一间屋子，或一个超净台内做RNA实验；在RNA实验中可...
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RNA 真不好提取，这是我在网上看到的，和大家共享！！对大部分实验人员来说，RNA 抽提比基因组 DNA 抽提要困难得多。事实上，现有的 RNA 抽提方法/试剂，如果用于从培养细胞中抽提 RNA，比抽提基因组 DNA 更方便，成功率也更高。那为什么同样的方法用于组织 RNA 的抽提，总会碰到问题呢？组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是说，培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质 – 用嘴碾磨，肠胃抽提。究竟怎样才能确保 RNA 抽提的成功率呢？实验前选择合适的方法/试剂，这是最重要的一步；好的方法/试剂在确保成功的同时，操作方便，经济实用。当然，您的选择可能仍然有问题，这就需要能正确分析实验失败的原因，以便改进。实验前方法/试剂的选择0：抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，劳民伤财。1：样品的收集/保存 – 影响降解的因素样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。2：样品的破碎及匀浆 – 影响降解和得率的因素样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。3：裂解液的选择 – 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。4：纯化方法的选择 – 影响内源杂质残留，抽提速度的因素对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。
编辑: ludongcn
作者:taozicao
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