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第一荣康医院医疗设备招标公告
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招标业主/代理：河南第一荣康医院
项目正文 关于河南第一荣康医院医疗设备采购项目技术参数公示
各潜在供应商：
河南省机电设备国际招标有限公司受河南第一荣康医院委托，就河南第一荣康医院医疗设备采购项目进行公开招标采购，依照“河南省财政厅关于进一步规范政府采购操作执行行为有关问题的通知”豫财办购[2007]20号文件相关规定，现将招标项目技术参数及功能描述网上公示，请各潜在供应商对公示的内容是否有倾向性、歧视性、排他性等内容提出意见或建议。
所有意见或建议应于2012 年 4月27日下午17:30(北京时间)前以书面形式向河南省机电设备国际招标有限公司提出 (加盖单位公章且法人签字)，由法定代表人或其授权代表亲自携带企业营业执照副本原件及本人身份证件（原件）一并提交（邮寄、传真件不予受理），逾期不予受理。
址：郑州市东明路187号金成大厦B座10楼106室
联系人：唐奋扬 石璐璐
河南第一荣康医院设备采购项目
全自动化学发光免疫分析仪配置及技术参数
全自动血培养配置及技术参数
全自动血培养配置及技术参数
超声切割止血刀配置及技术参数
超声切割止血刀配置及技术参数
冰冻切片机配置及技术参数
图文信息管理系统配置及技术参数
图文信息管理系统配置及技术参数
图文信息管理系统配置及技术参数
图文信息管理系统配置及技术参数
图文信息管理系统配置及技术参数
图文信息管理系统配置及技术参数
液基薄层制片机配置及技术参数
眼底相机配置及技术参数
环氧乙烷低温灭菌器配置及技术参数
超声清洗机配置及技术参数
医用干燥柜配置及技术参数
纯水设备配置及技术参数
文件条目号
设备名称、数量
消毒供应中心用纯水设备
主要性能配置和技术参数
产水水质：符合国家卫生部颁发的消毒供应室中心行业标准提出的用水要求，同时水质电导率≤5μS/cm。
设备工艺：三级预处理过滤+进口反渗透过滤+消毒系统+循环供水装置。
产水量：；产纯水（反渗水）量：2000L/H。
电源：AC380V三相五线，功率3KW。
深层过滤，内毒素、细菌去除率：≥99%
机械、活性碳过滤器加药装置：1套。进口品牌罐体和进口全自动冲洗控制器。
反渗透主机：1套。要求进口反渗膜，主机架采用全不锈钢，。
精密过滤器：1套。
细菌过滤器：1套。
压力开关、电磁阀等核心配件采用进口品牌。
高灵敏度的电导率传感器精确连续在线监测水质，保证产水质量。并有各级预处理和反渗透压力监测、废水流量、纯水流量等显示。
多种保护功能，能在无水、低压、高压的情况下自动保护，确保系统安全运行。
纯水设备配置及技术参数
设备全自动控制，预处理采用进口全自动冲洗再生装置,操作方便，设备故障率低，运行安全、稳定、节能。
外形简洁美观，占地面积小，预处理、主机一体化，完全考虑国内不同水源等因素。
配置内镜工作站
台面、洗消槽为一整体，都采用优质的改性PMMA高分子材料（化学名：甲基丙烯酸甲酯，远非普通亚克力及ABS复合材料可比），经多层复合，具有抗压强度高，弹性好，耐侯性优良；抗氧化，耐强酸强碱；表面光滑，易清洗；耐磨损，寿命长，损伤后极易修复；对内镜无磨损、人体无毒性等特征及优点。
配合内镜外型，采用凹凸不平的结构，同时在有限的空间内保持内镜最大的弯曲半径，可放置于方槽上方便的移动，即具备节约酶液和消毒液的功能，又可做阳性浸泡槽。
背板一次性整体吸塑成型，采用面层为PMMA的优质改性复合材料，其厚度约4mm,经二次热合成型加之特定的生产工艺流程，防腐防潮，永不生锈，表面无需再做任何其它处理，材料本身具有抗紫外线老化的特性，具有玻钢背板、冷扎板背板、钢板背板、玻璃背板、木质装饰板材等无与伦比的特征和优势。倾斜式操作面板平面设计，从光学、人体工程学及美学方面考虑，有效的缓解了操作时手部的疲劳与不适，从视觉效果上有效的避免了眩光对操作人员眼睛造成的刺激，再加之灯箱、操作面板安装平面与背板为一次性吸塑成型，除了与台面连接的水平缝外无多余的水平接缝——整体性能好，不藏污纳垢，防水防潮，防污染，清洁保养方便快捷、安全无忧。与槽面的尺寸相一致，搬迁、重组、升级方便灵活
优质304#不锈钢材质，杜绝纯净空气通过枪体腔道的二次污染，防止枪体腔道腐蚀而产生的脱落物进入内镜腔道，从而造成内镜损坏；特殊订制的内镜清洗专用喷嘴，能适用不同口径的内径接口。压力：0～0.75MPa，由中心气体处理器精确调控气压，压力可准确显示数值，安全可靠，无需在枪体上进行多余的、不精确的、感觉性操作。内镜作为一个精密和昂贵的诊疗设备，从洗消效果和内镜安全上讲，当然都需要对其进行精准的气压控制。
供气压力：max0.75MPa
供气量：65L/min
储气量：30L
噪音≦60分贝
电压：220V
输出功率：550W,为内镜清洗工作提供纯净的压力空气来源。
※7包中标商需免费配送过氧化氢低温等离子体灭菌器一台（容积≥100升），相匹配的生物培养箱一台，等离子专用指示卡、胶带、包装袋、灭菌剂、生物指示剂一部分试用。塑封机一台
麻醉机配置及技术参数
麻醉机配置及技术参数
麻醉机配置及技术参数
康复理疗设备配置及技术参数
康复理疗设备配置及技术参数
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版权所有(C)向SQL Server中导入数据时总是在最后一步出现错误，查看报告里是下面的内容，这是什么情况？怎么解决啊？_百度知道
向SQL Server中导入数据时总是在最后一步出现错误，查看报告里是下面的内容，这是什么情况？怎么解决啊？
正在验证 (错误)消息错误 0xc02020f4: 数据流任务 1，返回的验证状态为“VS_ISBROKEN”: 数据流任务 1: 一个或多个组件未能通过验证: 任务验证期间出错，无法处理此列: “目标 - sql123”验证失败。 (SQL Server 导入和导出向导) 错误 0xc0024107: 数据流任务 1。 (SQL Server 导入和导出向导) 错误 0xc004706b: 数据流任务 1。 (SQL Server 导入和导出向导) 错误 0xc004700c: 由于为列“price2”指定了多个代码页(65001 和 936)
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你的源文件excel中有错误。错误在于price2这个列名是两列的合并列名。请将他们分开命名再导入。
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应用Endnote插入的参考文献的word反应特别慢，该怎么办？
如题，我现在就遇到了这种问题，不知道各位大侠以前有遇到过没，给点经验！！
Originally posted by qijingji10 at
如题，我现在就遇到了这种问题，不知道各位大侠以前有遇到过没，给点经验！！ 正常，第一次比较慢，接着就好了 机子好点就行 呵呵 可能是电脑问题吧！有时候第一次是这样的 后面就好了！ 你应该将机子的配置也要说明一下，以及两个软件的版本~ 这种情况是endnote和word版本不兼容造成的。
关闭word的自动更正，语法检查等“即时”功能！ 换电脑哪。 ============
qijingji10(金币+1):谢谢参与
qijingji10(金币+1):这个倒还没注意，可能是机子配置的问题！！
这种情况是endnote和word版本不兼容造成的。
关闭word的自动更正，语法检查等“即时”功能！
==========
不是机子配置的问题。
是word的配置问题。
我遇到过这样的问题，也是这样解决的。 简单，换台配置高的电脑 :tiger29: 把word的自动校正 跟endnote的自动更新关掉
07/10建议用 X4版本 Word选项 -> 校对 -> 将“在 Word 中更正拼写和语法”内的所有选项取消即可 。:D 我两台电脑，配置好的那台出现了问题，配置差的没有。我发现是word的设置问题，另外把 instant format 关闭就好了。 :hand:换版本 就okl 可能版本有问题 把word中的自动检查拼写错误就可以了。
var cpro_id = 'u1216994';
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淘豆网网友近日为您收集整理了关于双耐药基因导入脐血干／祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究的文档，希望对您的工作和学习有所帮助。以下是文档介绍：双耐药基因导入脐血干／祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究 中华血液学杂志 2001年 4
22卷第 4峭 Chi z-J Henmto].Apnl o.001.v
22.№ 4 双耐药基因导入脐血干/祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究王季石 夏学鸣 陈子兴 卢大儒 薛京伦 阮长耿【摘要】 目的探讨转染醛脱氢酶基因(ALDH3)和多药耐药基因(mdr-I)的人脐血 cD
细胞肫否同时增强对活性环磷酰胺(4-HC)和 mdr-I基因靶药的抗性。方法 构建含 ALDH3和 mdr--I双耐药基因的逆转录病毒表达质粒 G】Na-ALDH3一IRES MDR1.经]JpofectAMINE舟导转染包装细胞,采用舍 4一 Hc和长春新碱(yea)的蜡养基克隆选择后收集重组病毒上清于单向型 GP+E86与双嗜型 PA317包装细胞行乒乓交互感染,将古 ALDH3和 mdr-l双耐药基因重组病毒的上请在细胞生长因子刺激下重复感染经免疫磁珠分离系统(MACS)纯化后的人脐血 CD,
细胞,用 PCR、RT-PCR、Soothem blot、Northern blot、 FACS和(来源：淘豆网[/p-5897781.html]) M竹等方法检测外振 ALDH3与 mdr-l基因在 CD
细胞中的转移和表达。结果 MACS分离纯化后的人脐血 c
细胞纯度平均选 91% ,回收率为 72% .含双耐药基因重组病毒的上清最高滴度为 6.5 x10’CFU/ml,应用集落计数、PcI{和 FACS方法测定基因转导效率分别为 18.O%、20.O% 和 J6.7% ,未检测到辅助病毒存在,有 P170功能的细胞占 16 O%,经双耐药基因修饰的脐血 c
细胞对4,-￣1C的 c 鞍对照组提高 3 5倍,对 X:CR和柔红霉索的 jc 较束转染细胞分剐商 6 8和 5.5倍。结论逆转录病毒载体舟导双耐药基因转导脐血造血干/祖细胞获高教共表达。【美生词】基因;
多药耐药; 载体; 造血干细胞;
基因疗法; 胎血 Improvement
bination chemotherapy tolerance of human umbilical cord bioed C
cells transducted with doubl(来源：淘豆网[/p-5897781.html])e dr
resistance genes
a bicistronic ret￣ viral vector
,XIA Xu￣ ing, CHEN 缸一. et af.Jiangsulnsattae ofItemato￣ogyt First Affdia￣e3Hospital ofSuzhouMedical College,& dⅡ 215006, Ch/na I Al￣trsm]
Objective To explore whether h￣msn umbilical cord blood hematopoietic progenitor cells nans— dueed with hu.maa aldehvde dehydrogenase class 3(ALDH3)and muhidrug resistance gent(MDR1)could increase resistance
4-hvdroxycyclopbosphamide【4-HC)and P-g(来源：淘豆网[/p-5897781.html]) ycopro ein eflluxed drugs
A bielstronic retro— viral vector G1Na—ALDH3一IRES-MDRI eDNA wils eotmtructnd
and transfected the packaging cell lines GP +E86 and PA317 by LipofectAMINE method ,using the medium eonlainthg VCR aad 4-HC for cloning selection aad ping- ponging supernatant infection between eeotropic producer clone and amphatropic ptnd ueer
cord blood c cells were enriched with a hi
-gradient ic cell sorting system(MACS),and then(来源：淘豆网[/p-5897781.html]) repeatedly transfoeted
lII supernatant of retro￣rus containing hunuul ALDH3 an d MDR1 eDNA under stimulation of hematopoietic growth foe, tom.PCR ,RT_PCR.Southern blot.Northern blot.FACS and M2q'assay were used协 evaluate the
a1日 c and expres￣on of the double genes Rem/ts
The pufiff of cord blood c
cells was approxlmately 91% and the recovcu'rate was 72% The highest titer of reeombimmt
1pl1olropic retrovirus in the supernotant w珊 up to (来源：淘豆网[/p-5897781.html])6.5 x 1旷 CFUIm1.The elficieney 0f ransduction was18% ,20% and 16 7% tested by colonyfommtion.PCR and FACS,respectively.1thnd anfine 123 efllux showed 16% transduced cells with P-gp function
No helper&drtm
aB found by both nested PcR and rescue assay.
e MTI&anal
showed a 3 5to 6.8-foM inere.me ofresistance of transducted
cells to cyclophosphamide and P-glycoprotein effluxes drug pared with the nontransduced cells CorselutCton
Thediici(来源：淘豆网[/p-5897781.html])enny 且nd eo—e 玳储i0nof t e dual germstransfer system prodded afound ationfor ameliorat— bination che motherapy toxicity in clinical trial 【Key wort￣】 C
Resistance,
Yector: Heraatol￣ietic
Ger,e therapyt
Um- bilical cord blood ·论著· 基金项目:国家自鼎科学基金(){贵州省科委基金(E97-5)资助项目作者单位:215006 苏州犬学附属第一压院血被科、江苏省血被研究所_王季石(现为上海医科大学华山医院血蒗内科博士后),夏学鹏,脒子兴、阮长耻’:复旦大学遗传学研究所(卢太懦薛泉论) 维普资讯 血液学杂志 2001年 4月第 22卷第 4期 Chin JHereto[,April 2001(来源：淘豆网[/p-5897781.html]),v0I 22,N0 4 化疗迄今仍是治疗肿瘤的主要手段,化疗过程中肿瘤细胞产生多药耐药性是影响化疗效果的重要障碍,提高造血干细胞内与耐药相关的蛋白质或酶的含量,已经成为肿瘤基因治疗的一个重要内容。环磷酰胺(CTX)是临床化疗中最常用的烷化剂之一, 近年来的研究表明,细胞色素 P450能催化 CTX 形成体内具有活性的 4.羟 CTX(4.HC),其开链形式醛磷酰胺经口消除反应后可形成丙烯醛和磷酰胺芥子而产生细胞毒作用,人醛脱氢酶基因(ALDH3)的长度为 1.5 kh,所编码的蛋白质由 453个氨基酸组成 。ALDH3氧化醛磷酰胺形成无毒的羧基磷酰胺,因此,细胞对 CTX耐药性与 ALDH3基因的表达密切相关 。多药耐药基因 m[1r_l表达产物 P-170 具有跨膜药物外输泵功能,作用底物包括许多临床最常用的抗癌药如长春新碱(VCR) 、柔红霉素(DNR)、高三尖杉酯碱(HHT)等,因此 mdr-l基因是用于化疗时造血千细胞保护性基因治疗最理想的靶基因。由于临床上对肿瘤的治疗多采用联合用药(来源：淘豆网[/p-5897781.html]), 因此有必要对造血干/祖细胞转导由几个不同耐药谱基因组合在一起的多价基因,以增强骨髓造血干细胞的耐药表型 本实验中我们采用新近发展起来的多基因表达技术 ,将 ALDH3与 mdr-1基因同时构建在一个用于多顺反子表达的逆转录病毒载体上,转导脐血造血干/祖细胞,进行两种不同耐药基因的表达研究。材料和方法 1
主要试剂 wi za】 DNA clear.up 试剂盒, T4DNA连接酶和其他工具酶为 Bio—lib和 MBI公司产品,LipofeetAMINE、胎牛血清(FCS)、DMEM 培养基、细胞因子、RNA抽提试剂盒 TRIZol为 Gibco.BRL 公司产品,VCR、MTI&、Polybrene为 Sigma公司产品, Ct=32P-ATP购自美国杜邦公司。 2 质粒、细菌和细胞株 pSXLC.MDR1、pLXSN- ALDH3分别由美国 NIC Pastan教授和 Cowan博士馈赠,大肠杆菌 TCI、人类白血病细胞系 K562、THP-I、 U937和 NB.4、鼠源(来源：淘豆网[/p-5897781.html])单向型 GP+E86、双嗜型逆转录病毒包装细胞 PA317、小鼠成纤维细胞 NIH3T3为本室传代保存。 3 脐血细胞的采集分离 采月j免疫磁珠分选系统(MACS)分离 CD
细胞,具体方法按试剂盒说明书进行。流式细胞仪测定纯度,标记抗体为 HTc结合的鼠抗人 CD 单克隆抗体(HPSACD)。 4 表达双耐药基因重组逆转录病毒载体的构建以相同酶切重组质粒 pLXSN.ALDH3与 pBluescript, 连接转化后获得 pBlue.ALDH3,以同样酶切 cl№框架,除去 Neo基因片段,连接后获得重组质粒 c1Na— ALDH3,酶切 pSXLC.MDR1,回收 IRES.MDR1cDNA. 再与经 CIP处理后的 GlNa.ALDH3相连,获得重组逆转录病毒表达质粒 CINa-ALDH3.IRES.MDRI。质粒的转化、扩增、酶解、片段回收及连接按常规方法进行。 5 重组逆转录病毒的体外包装及病毒滴度测定以 LipofeetAMINE 介导将 cl Na.ALDH3.IRES.MDR(来源：淘豆网[/p-5897781.html])1 导人 GP+E86和 PA317包装细胞,3 d后收集上清, 以 NIH 3T3细胞为靶细胞,用含 VCR(50 n异/m1)的 DMEM培养基连续筛选 14 d,计算细胞克隆数。 6 乒乓感染法提高重组逆转录病毒滴度 将单嗜型(cP+E86)重组病毒悬液(Polyb￣ene 8 ms/L)过滤除菌后加人到 24 h前传代并已达 50%融合的双嗜型包装细胞(PA317,l旷/2 m1),于 37℃感染 2 h, 加人新鲜 DMEM 至 polybrene的浓度降至 2 ms/L,继续培养 48 h,按 l:10传代后分别以 4.HC(1O~40 t￣nol/L),VCR(50~2OO ngtm1)选择至耐药的双嗜性细胞出现,此过程交替反复进行 7 重组逆转录病毒感染 CD
细胞 当 DMEM 中培养的重组逆转录病毒生产细胞达 70% 融合时,即换成体积分数为 20% FBS的 1MDM培养液继续培养 24 h后收集上清,转染前 48 h将人脐血 CD
细胞于含体积分数为 20%的 FBS,50 n异/盯d GM—CSF, 50 ns/ml rhSCF,50 nS/ml IL-3,30 n异/lIl1 IL.6的 IMDM 中预培养,离心弃培养液,将病毒上清及同样浓度的细胞因子及 5峭,
的鱼精蛋白一并加人,每天换液,连续 5 d后收集细胞。 8 巢式 PCR及补救分析检测野生型逆转录病毒逆转录病毒介导的基因转移中,用于感染靶细胞的病毒为一次性感染并无复制能力的重组缺陷性病毒,故后感染的靶细胞不应带有病毒结构基因,以双嗜型小鼠白血病病毒 dO70A 的 env基因合成引物,envl Sense: 5 .cccAG1 cT℃. 3 , Antiseneel:5 e.AGTAAGC一3 , env2 Sense:5 TGATGACTGGGCG-3 ,Anti— sence2:5 -CCCGACm 一3 ,以上述病 毒生产细胞上清感染的白血病细胞系靶细胞基因组 DNA为模板进行 PCR,以 PA317为阳性对照,扩增产物经 l5 g/L琼脂糖凝胶电泳分析并照相。同时采用 3T3放大实验检测辅助病毒,用含 GINa—Neo'-ALDH3 维普资讯杂志 2001年 4月第 22卷第 4期 Chin J Het￣to1.
,V — No.4 重组病毒生产细胞 PA317的上清转染 NIH3T3细胞, 以 G418筛选得到 G418 333 细胞,将此细胞传代 3 周+上清用 0.45 t,tm 滤膜过滤,用 1
感染 G418 31&3细胞,G41 8选择培养 14 d后计数 G418 克隆。 9
PCR分析及 PCR产物 Southern blot杂交按常规方法提取转染细胞基因组 DNA,用 PCR检测耐药基因整合状况,引物序列为 ALDH3:A 5 .AGCAG— GTGAAG一3 . B
5 -GATGG—.3 ;mdr-1: A 5'-CCCATCA'ITG- CAATAGCAGG-3 , B 5 -GTI￣AAAC'TCA一 3 ,PCR参数为 95℃ 45 s,55℃ 1 rain,72℃ 90 s, 共 30个循环。另将 PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后按分子克隆方法进行转膜及烤膜,按标准程序分别将 ALDH3 cDNA和 mdr-1 cDNA以 n一 P标记作为探针进行 Southern blot杂交。 10
RT-PCR、Northern blot检测转染靶细胞中双耐药基因转录水平表达 细胞总 RNA 的提取方法按 TRlzol试剂盒说明进行,经逆转录后进行 PCR,引物和 PCR条件同上。收集(1~2)x l
个细胞,提取细胞总 RNA,用含甲醛的凝胶电泳分离 RNA样品, 紫外灯下测 28S rRNA 与 18S rRNA至电泳原孔位置,将 RNA吸印转移至硝酸纤维膜(NC膜),80℃烘烤固定 2 h,预杂交 4 h后加入变性后的.”P标记的 ALDH3 eDNA和 mdT-1 cDNA,继续于 42℃杂交 20 h,经重复洗膜后置一70℃冰箱放射自显影。 l1
流式细胞术(FCM)检测 P.gp表达 按本室建立的直接免疫荧光法进行;取 10 个细胞,用 PBS洗涤,加入 I
g PE标记的 UIC2单抗或对照,4℃ 30 min,PBS洗涤后用 FCM分析 10 000个细胞的平均荧光强度与阳性率。 12 基因转导效率分析将感染后人脐血 c
细胞(5×lo},Hd)在含上述细胞因子及相同药物浓度的体积分数为 20%的 FBS、10 glL甲基纤维素半固体培养基中培养,于体积分数为 5%的 c02、37℃培养 14 d,倒置显微镜下观察+对≥50个细胞的集落进行计数,采用以下方法分析基因转导效率:①基因转移效率(% )=(双靶药抗性集落数,未用靶药的总细胞集落数)×100% ;②用微量吸管吸取分离良好的单个集落,经扩大培养后,采用煮沸法,提取细胞基因组 DNA进行 PCR.分析基囡转移效率;③采用 FCM 检测转基因靶细胞 mdr-I基因表达产物 PI70阳性率,用 Rh.123排出试验检测 Pl70功能。 13 细胞存活分析用 M'IT法测定 ;2×10 个细胞种植于 96孔板,分别加入 4.HC(10—40 mdfL) 和 VCR (50—200 n lT11),37℃、体积分数为 5% 的 c
全湿培养 48 h,每孔加人新鲜配制的 MTY工作液 20 I,37℃培养 4—6 h,每孔加人 100t,l DMSO, 用酶联仪测定 A sw值,计算,c 结 果 1
重组质粒 GINa.ALDH3.IRES.MDRI的酶切鉴定结果鉴定结果如图 1,采用四组不同酶切鉴定证实约 4.6 kb的 GINa空载体正确连接了 ALDH3(1.5 ,),mEs.MDRI cDNA(4.6kb)片段。 l 1}重埋质粒 e∞ M
XhoI单爵切;2:G
M用 BamHl,Hand IU职酶切;3:E∞RI酶切{4:未用酶切;5:
I酶切;6:标准相对分子质量 Lambda DNA,tP￣tEⅡ Market(
) 圈 l 重组逆转录病毒载体 c1N￣ALDH3.IRES—MDRIIGL3M) 酶切鉴定图谱 2 脐血 c
’细胞的分选、纯化分选前的 c 细胞纯度为 2% ~6% ,分选后可达 86% ~95%,平均纯度 9l% ,回收率为 72%。 3 高滴度产病毒细胞系的建立将重组质粒以“一 pofectAMINE介导转染 GP+E86细胞,经 VCR筛选后将其上清感染 PA317细胞,用上述两株细胞克隆上清进行乒乓交互感染 4个周期,分离 PA317细胞克隆,最高滴度为 6.5×l
CFU/ml。 4 辅助病毒的检测 以 PA317/GL3M 最高滴度病毒上清,分别感染白血病细胞株 K562、THP.1和 U937细胞,提取基因组 DNA,以病毒结构一v基因引物进行巢式 PCR扩增,结果显示双耐药基因修饰的三种细胞未见扩增条带.而内对照 mdr-I为阳性(157 bp),但 PA317细胞经 enV基因引物扩增后出现 224 bp条带(图 2),表明该基因转移体系中无辅助病毒产生。在补救分析实验中,将 GlNa—Neo 一 ALDH3修饰的 NI￣ T3上清再感染 N1H3I&3受体细胞,经 G418选择两周后无抗性克隆存活,从而在功能性检测方面也证实无辅助病毒产生.表明该基因维普资讯 液学杂志 2∞1年 4月第 22巷第 4期 Chia J Hemm
2001,Vo【22
o 4 转移体系具安全性。 5 外源基因整台人转染靶细胞的检测 提取转染靶细胞基因组 DNA为模板,PCR证实各转染细胞均可扩增出耐药基因片段,以 ALDH3和 mdr.1基因探针进行 PCR产物的 Southern blot分析.结果表明外源基因已整台人靶细胞基因组(图 3)。囊_
I:标准相对分子质量 pUC19DNA/MspI M2,3:PA317包装细胞 4:K:562细胞/GL3M;5:'/'HP-1细胞/GL3Mt6:U937细胞/GL3ld 圈 2 筑巢式 FCR检甜辅助病毒…基因_● 8
b ㈣1 4 GL3M转染的脐血 c
细眶中 ALDH3基因的整合;5:阴性肘照(呱 细胞,未转导) bI 阴性对照(c
细胞,未转导);2~5:GL?,M 转染的脐血 c 细帕中 mch'-I基因的整台圈 3
m bl0l分析转染 cD
细胞巾双耐药基因整合结果 6
RT.PCR和 Northern blot检测耐药基因在转染靶细胞 mRNA水平的表达 提取细胞总刚 A,经逆转录合成 eDNA,并以其作为模板,分别加入 ALDH3与 mdr-1引物进行 PCR扩增,反应产物为阳性,再将 ALDH3与-nd|_1 eDNA用放射性棱素 P标记,分别与转染细胞总 RNA进行 No.hem 杂交,结果显示目的基因在转录水平得到表达(图 4,5)。 7 基因转导效率铡定 未加任何药物的人脐血 CD ’总细胞集落数为 120.0±10.0,在含有 4一HC和 VCR的半固体培养基中细胞集落数为 22.0±4.5, 基因转导效率大约为 18% ;分别挑取半固体培养基中转染细胞集落基因组 DNA进行 PCR,结果显示, 在含有 4-HC和 VCR的半固体培养基中细胞集落均同时扩增到 AL3和 mdr-1基因片段,在 20个未加任何药物的细胞集落中有 4个集落同时扩增到双耐药基因片段,转导效率为 20% ;用 FCM 检测其 mdr-1 基因表达产物 PI70,以未转基因组细胞为对照,得出转导效率为 16.7%。Rh一123排出试验也显示有 PI70功能的细胞占 16%,表明转基因 CD
细胞 P. gP表达与 Rh-123排出活性之间存在明显相关性。 ll I,5:标准相对分子质量(10o hD DNA梯式条带);2.3:分剐为 RT-PCR 扩增 GL3M转染的脐血 CD 。 细胞中 ALDH3和 md I基因;6,7:分铡为 RT-PCR检测转染的 PA317细胞中 md I和 ALDH3基因;4:未转染的脐血 c
细胞中 ALDH3基因为阴性;8,9分别为空载体 G1Ha 转染的脐血 cD
细胞中 nxk-1和 ALDH3基因为阳性圈 4
RT.PCR 檀测 GL3M转染的脐血 C
细胞中 ALDH3 和 mdr-1基因转录表达 B
tin I:阴性对照(c
细眶/未转导);2,3:
P标记 ALDH-3 eDNA探针播测 GL3M转染的脐血 c
细胞中皿耐葑基因转录奉(6 I kb);4, 5; P标记 mdr-1 eDNA探针检测 GUM转桀的脐血 CD
细胞中双耐药基因转录本(6.I kb);6:阴性对 jfIl(c
细胞,未转导) 圈 5
Northern blot分析转染细胞中双耐药基因转录奉 8 转耐药基因靶细胞对化疗药物的耐受性 采用 M'I'Y法分析转染的 c
细胞对 4-HC药物产生抗性,其 Ic 值由未转的 5￣molfL增加到 17.5.umollL, 增加了 3.0倍,经双耐药基因修饰的 CD
细胞对 VCR和 DNR的 Ic 分别由 12 n
增加到 82 n 和 66 g,L增加到 364 ug/L,分别增高 6.8和 5.5倍, 结果表明,逆转录病毒介导的双耐药基因对脐血造血干/祖细胞能有效转移并同时表达各靶药抗性。 9
FCM检测转基因靶细胞 P-gp表达为研究 IRES 引导转录本进入核糖体翻译的能力,用膜外单抗 U1C2与 FCM方法分析转染基因的翻译水平,并与未转染基因细胞比较,结果显示,转染后的细胞平均荧光强度和表达率明显高于对照组。维普资讯 血蘸学杂志 2.￣01年 4月第 22卷第 4期 Chin JHemald ^pr】l 2啦 l Val 22,No 4 讨 论耐药基因转导正常造血干细胞是肿瘤基因治疗的一种策略,对造血干细胞转导单个基因可以增强被转导细胞对一种或一类药物的抗性,采用多个耐药基因共同转导则可增太造血干/祖细胞的耐药谱, 扩大 I临床对化疗药物的选择余地。ALDH3在人类造血干细胞(HSC)中的表达水平比较低,cD
细胞亚群功能性表达的 ALDH3水平不足以对抗化疗药物引起的骨髓抑制 。我们将 CTX抗性基因ALDH3 通过脑心肌炎病毒(ECMV)内核糖体进入位点(IRES)与 mdr-1基因相连,构成双顺反子逆转录病毒表达载体,双基因同时受控于 5 端的 LTR,wdr-1 基因转录由 LTR启动,翻译则由 EMCV IREs引导, 故在 rnR A 水平只有一个转录本,仅转录产生由 LTR启动的单一全长 mRNA链,在 Northem 杂交时, 不论使用上游基因或者下游基因做探针,均出现单一条带,而 PCR和 RT.PCR则可扩增出不同的目的基因。在翻译蛋白质时,ALBH3基因通过真核的帽依赖方式翻译合成蛋白质,而 mdr-1在具有内启动作用的 IRES元件控制下进行帽非依赖型翻译,从而避免了两个启动子的相互抑制作用,因此为不同基因的等效表达提供了基础 。为获得更高的表达活性,除乒乓效应增加病毒滴度外,将 mdr-1作为显性选择基因,以 VCR进行压力选择,即低水平的翻译被高水平的转录所代偿,并使上游基因 ALDH3处于高表达水平,故双耐药基因同时得到有效表达。实验结果显示,转基因 CD
细胞对 4-HC的 较对照组提高 3 5倍,对 VCR和 DNR的 较未转染细胞分别高 6.8和 5.5倍,因此,双耐药基因的转导使造血干/祖细胞受到多重保护,对消除联合化疗导致的骨髓抑制提供了可能性,显然较单基因的导人更有意义。目前,造血干/祖细胞的 1基因转移方案已应用于实体瘤患者。并显示出广阔前景 。我们经 PCR、RT.PCR、Sou￣em blot、Northern blot、 FACS及 MTI&证实含双耐药基因的逆转录病毒载体确能将多个外源基因导人脐血造血干/祖细胞,并同时进行表达且产生药物抗性,这将为临床超剂量化疗以求最太限度杀伤肿瘤细胞并能多次重复进行化疗提供了实验依据 我们以 PA317细胞内所含的病毒反式结构基因 env设计两对 I物,对抗性基因修饰的几种细胞均未扩增出 eYIV基因,而阳性对照 PA317为阳性,表明本基因转染体系中无辅助病毒产生,经补救分析等方法均未发现有 RCR产生,证明该基因转移系统是安全的。有关耐药基因导人造血干细胞后能否长期稳定表达,对靶细胞的生理功能有否影响,还有待于进一步实验研究。参考文献 1
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双耐药基因导入脐血干／祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究 中华血液学杂志 2001年 4
22卷第 4峭 Chi z-J Henmto].Apnl o.001.v
22.№ 4 双耐药基因导入脐血干/祖细胞降低联合化疗骨髓毒性作用的临床前研究王季石 夏学鸣 陈子兴 卢大儒 薛京伦 阮长耿【摘要】 目的探讨转染醛脱氢酶基因(ALDH3)和多药耐药基因(md...
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