包涵体的形成原因及其处理方法_百度文库
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包涵体的形成原因及其处理方法
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蛋白上清表达无活性，求复性方法
我的蛋白在上清中有大量表达，但是做EMSA检测无活性，看文献中是降低盐酸胍浓度来复性的。有没有人做过柱上复性的？想知道具体方法。我是应该直接按包涵体的方法复性还是上清在镍柱纯化的同时复性呢？另外蛋白中有几个半胱氨酸，没有二硫键，是不是一定要加巯基乙醇来保护巯基？
但是上清无活性呀
有按参考文献加入镁离子，不知道是不是没有加还原剂保护巯基的原因，如果需要加还原剂一般是多大浓度包涵体蛋白的复性研究进展_百度文库
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包涵体蛋白的复性研究进展
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你可能喜欢请教：关于原核表达包涵体蛋白纯化 - 实验交流 - 生物秀
标题: 请教：关于原核表达包涵体蛋白纯化
摘要: [请教：关于原核表达包涵体蛋白纯化] 相关疾病：头痛我做原核表达已经一个月了。表达的蛋白在包涵体中，最初的策略是想改变诱导条件使其可溶，方便纯化。但是无论如何改变条件，都无法达到。IPTG降到0 07mM, 温度到14度，转速80转 min，也无济于事。起始OD值也改变过好几次。现在想放弃上述策略，改纯化包涵体算了。但我的目的蛋白表达比较低，同时沉淀中还有很多杂蛋白。我的裂解方法是收集菌液，离心沉淀置于－70度过夜，加入1％Trito 关键词:[包涵体 蛋白表达 原核表达包涵体 蛋白纯化 裂解液]……
我做原核表达已经一个月了。表达的蛋白在包涵体中，最初的策略是想改变诱导条件使其可溶，方便纯化。但是无论如何改变条件，都无法达到。IPTG降到0.07mM, 温度到14度，转速80转/min，也无济于事。起始OD值也改变过好几次。现在想放弃上述策略，改纯化包涵体算了。但我的目的蛋白表达比较低，同时沉淀中还有很多杂蛋白。我的裂解方法是收集菌液，离心沉淀置于－70度过夜，加入1％TritonX－100的PBS裂解液，加入蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)(protease inhibitor)，加入溶菌酶后匀浆10s，两次（本实验室无超声），冰上30min后，置于室温或37度20min，直至澄清粘稠加入DnaseI, 室温10min， 15000g离心30min，去沉淀电泳，如图。现在头疼的是杂蛋白太多了，还有一条很浓的条带，不知道是什么，在30kd左右，请教各位朋友，有什么方法可以纯化？我用来打兔子作多抗的
PAGE后,切胶,捣碎,加,打兔子即可.
请问，你的表达菌是不是BL21（DE3），在30KD处的杂带很正常，我的也有，并且比你的条带还量大，极度怀疑是菌体本身条带！！
表达菌是BL21（DE3），那如果切胶回收的话，要重复无数次，才能达到免疫兔子所需要的量的吧
请问楼上兄弟PAGE胶捣碎用的什么方法？还有就是这样免疫动物有作用吗？
可以采用过亲和层析柱，或者是在溶解包涵体之前多离心，尽可能除去杂蛋白，然后离心收集包涵体，效果不错，简单实用。
PAGE胶捣碎有用
包含体多洗几次（重点），不同的，溶解后复性，应该较容易
如果做的表达系统是pET系统,温度和培养基的盐离子浓度很关键的。好象是低温（28）和高盐利于表达在上清上，可是实际上清的杂带比沉淀中还要多一些。我们这也有表达量底的切胶后打动物的，反正前面要乳化的，用的变性胶也没事的，不影响的。
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