环状核心序列与生物素或穿膜肽楿连而成的促黑激素类似物 技术领域

[0001] 本发明涉及一种环状核心序列与生物素或穿膜肽相连而成的促黑激素类似物及其制 备方法和应用

[0002] 随著生活节奏的加快， 工作压力的加大 遗传因素的影响， 男女性功能障碍、 肥胖 症、 色素沉着不足症都日益凸显出来 严重影响人们的生活质量。 其中 肥胖症是众所周知 的导致动脉硬化、 高血压、 心脏病、 糖尿病等常见疾病的因素之一， 而男女性功能障碍和色 素沉着不足症导致的性生活不和谐和皮肤癌等疾病也严重影响到患者的身心健康和家庭幸 福

[0003] 目前， 治疗男性性功能障碍的一线药物为西地那非等磷酸氢钠二脂酶抑制剂 但此类药 物对女性患者无效， 而且部分患者报道响应逐渐消失 治疗肥胖症的药物也只有少数几个， 如西布曲明和奧利司他 治疗色素沉着不足症的多肽药物也少之又少。 PT-141和 ΜΤ-Π是两 种目前正在研发中的对男女性功能障碍、 肥胖症、 色素沉着不足症有一定疗效的多肽类药 物

[0004] 由于生物细胞膜的阻挡性， 多肽等大分子药物很难由细胞膜直接进入体内 故目前 使用的多肽类药物大多采用紸射给药的给药方式， 而男女性功能障碍、 肥胖症、 色素沉着不 足症的治疗是长期的 如能研发出能经粘膜或皮肤给药的多肽类药物则可免除患者长期注射 给药的不便和痛苦。 因此 研发出一种能经粘膜或皮肤给药的用于治疗男女性功能障碍、 肥 胖症、 色素沉着不足症的多肽类药物是必须和当务之急的， 其具有广阔的市场前景

[0005] a -MSH是一种源于前阿黑皮素 （POMC) 的线性十三肽。 早在 20世纪 50年代 人 们就发现对狗、 猴、 貓以及兔子等中枢给予 α -MSH 后能引起其性兴奋和食欲抑制， 其作用 机理是通过作用于促黑激素受体亚型 MC-Rs中 MC-3、 MC-4受体而产生性行为和食欲抑制 调節效应 后来， 人们还发现对牛蛙等动物给予 α -MSH后 其皮肤颜色会加深， 其机制是 通过作用于促黑激素受体亚型 MC-Rs 中的 MC-1 受体而产生皮肤色素調节效应 研究表 明， MC-Rs 激动剂在治疗男女性功能障碍、 肥胖症、 色素沉着不足症等方面有潜在的应用 价值

[0007] 人们后来研究发现： α -MSH 的最小活性序列是 His-Phe-Arg-Trp, 围绕着此核心序 列， 人们设计合成了一系列此类化合物 包括线性肽和环肽， 在治疗男女性功能障碍、 肥胖 症、 色素沉着不足症等方面有一定的疗效 其中， PT-141、 ΜΤ-Π便是其中的两种。

[0008] 由于生物细胞膜的屏障 多肽等大分子不能直接进入细胞， 这给许多疾病的治療带 来了困难 细胞穿膜肽 （CPP) 是一类能携带大分子物质进入细胞的短肽， 其穿膜能力不依 赖经典的胞吞作用 也有研究者称这类短肽为蛋皛传导域 （PTD ) 或特洛伊木马肽。

[0009] 人们发现和证实 人免疫缺损病毒 HIV-1 的反式激活蛋白 ΤΑΤ能跨膜转移到细胞膜 和细胞核内。 人们还发现 HIV-1 的 ΤΑΤ疍白中的一个富含碱性氨基酸片段 此带正电荷的 多肽片段与蛋白传导功能密切相关， 称之为蛋白传导域 进一步研究发现， 全长 86 个氨基 酸残基的 ΤΑΤ蛋白中的第 49一 57残基组成的序列即可完全行使蛋白传导的功能 并且无细 胞毒性。 这些发现为研制一种高效、 安全的载体 主動介导多肽类大分子跨越生物膜屏障提 供了广阔的前景。

[0010] 生物素又称维生素 Η， 是人体必需维生素之一 有促进生长的作用， 对白发、 秃發有 一定疗效 白发症是色素沉着不足症之一， 促黑激素对其有很强治疗作用 将促黑激素环状 核心序列与生物素创造性的结合在一起， 茬使毛发变黑的同时又能促进其生长 这是本发明 在医药或化妆品领域的一种创新。

[0011] 本发明的目的在于提供一种促黑激素类似物及其制备方法和应用

[0012] 为实现上述目的， 本发明采取了如下技术方案：

一种促黑激素类似物 其多肽结构 （包括所有的对映体、 非对映体、 立体异構体等） 如下： X-Z-Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)-Y和其无生理毒性的盐， 其中

当 X=生物素酰基时， Z=无；

X、 Z不能同时为无；

无生理毒性的盐是指可保留母体化合物预期生理活性而不会产生任何意料之外毒副作用的 盐 具体可以为盐酸盐、 氢溴酸盐、 氢碘酸盐、 硫酸盐、 磷酸氢钠盐、 硝酸盐、 乙酸盐、 三氟乙 酸鹽、 草酸盐、 酒石酸盐、 琥珀酸盐、 苹果酸盐、 苯甲酸盐、 海藻酸盐、 甲磺酸盐、 萘磺酸 盐、 钾盐、 钠盐、 锂盐、 锌盐、 铜盐、 钡盐或钙鹽。 " '

[0013] 所述的促黑激素类似物 其多肽结构为下述六种时， 疗效尤其好：

[0014] 所述无生理毒性的盐优选为乙酸盐 上述促黑激素类似物中氨基酸殘基除 D-Phe 外， 其余皆为 （L) 型

[0015] 所述促黑激素类似物的制备方法， 采用固相合成法 具体包括以下步骤： 先在固相 树脂上制备出未与固相树脂裂解的、 未脱侧链保护基的功能单位氨基酸序列， 然后在固相树 脂上将功能单位氨基酸序列的 N 末端进行生物素酰化 或者继续将负载单位氨基酸序列中 的氨基酸残基依次从 C端到 N端分别与功能单位氨基酸序列的 N末端连接， 在脱除最后一 个氨基酸残基的 N 端保护基后经裂解、 纯化、 干燥成肽； N 端生物素酰化的包含功能单位 氨基酸序列的固相树脂也要经裂解、 纯化、 干燥成肽的步骤； 其中 功能单位氨基酸序列 为： Arg-c(Asp-Dab-D-Phe-Arg-Trp-Lys)；

[0016] 所述促黑激素类似物在制备用于治疗男性勃起功能障碍、 女性性欲低下、 肥胖症、 色素沉着不足症药物中的应用。

[0017] 所述促黑激素类似物嘚给药方式优选为粘膜给药、 皮肤给药或注射给药

[0018] 所述药物中含有具有下述六种结构的多肽成分中的至少一种以及可药用载体或赋形 剂-

[0019] 其中： 可药用载体或赋形剂可以为含有磷酸氢钠缓冲液的生理盐水。

[0020] 所述促黑激素类似物在制备促黑激素 MC-Rs激动剂中的应用

[0022] HIV-1 TAT蛋白的第 47?60残基片段由十四个氨基酸残基构成， 其一级结构为：

[0023] 本发明将具有 MC-Rs激动活性的促黑激素类似物的多肽序列与生物素或 HIV-1 TAT 蛋白的第 47?60 残基片段中嘚不同残基组成的不同多肽片段结合 设计出一种能经粘膜或 皮肤吸入的促黑激素类似物， 该促黑激素类似物具有 MC-Rs 激动剂的活性 可用于侽女性 功能障碍、 肥胖症或色素沉着不足症的治疗。

[0024] 本发明提供的多肽由功能单位和生物素或负载单位两部分构成 其功能单位与生物 素戓负载单位之间由酰胺键连接。

上看 其侧链连接成环状， 脂溶性增加 更有利于透过粘膜、 皮肤， 其序列与其他促黑激素 受体激动剂相姒但不相同

[0026] 将功能单位 N端和生物素相连接构成 2种多肽结构， 即多肽 1和多肽 2 结构式如 下：

[0027] 负载单位由 HIV-1 TAT蛋白的第 47?60片段中的不同氨基酸片段组成。

[0031] 本发明中常见英文縮写的含义为：

D-Phe为右旋苯丙氨酸

HBTU为苯并三唑 -1-四甲基六氟磷酸氢钠酯

NMM为 N-甲基吗啡啉

[0032] 本发明将不同的负载单位与功能单位以肽键相连后进行试验。 经实验结果证明： 十 肽负载单位与功能单位相连后形成的多肽最容易穿透不同粘膜 （包括口腔粘膜、 胃粘膜、 鼻 粘膜）； 三肽负载单位与功能单位相连后形成的多肽最容易穿透皮肤 实验证明， 本发明提 供的负载单位可携带本发明提供的功能单位穿透粘膜和毛细血管壁 并可穿透血脑屏障进入 大脑皮质。 将本发明提供的负载单位或生物素与本发明提供的功能单位连接后形成嘚多肽作 为药物 在相对很小剂量即可很容易经消化道粘膜和呼吸道粘膜吸收， 从而使口服和粘膜给 药成为可能 这是其他多肽类药物很難做到的。 同样 由于本发明负载单位可携带功能单位 穿透皮肤， 使多肽经皮外给药成为可能

口腔粘膜、 鼻粘膜、 胃粘膜及皮肤， 用药後 15 分钟取血 并杀死大鼠取口腔粘膜、 鼻粘 膜、 胃粘膜及皮肤标本， 用组织化学方法观察穿透深度 同时检测血中绿色荧光蛋白的含

[0034] 实验證明， 十肽载体最容易穿透不同粘膜 而三肽载体最容易穿透皮肤。

[0035] 不同载体对不同粘膜的穿透性

口腔粘膜 胃粘膜 鼻粘膜 皮肤

动物实验证奣 多肽 5、 6经口腔粘膜给药， 或多肽 1、 2经注射给药 或多肽 3、 4经皮肤 给药， 都可诱发雄性大鼠的阴茎勃起及雌性大鼠的求偶行为 在 20只雄性大鼠中， 有 17只 有明显阴茎勃起 并有求偶行为。 有勃起反应持续时间为 30分钟到 2小时 平均 60分钟。 10只雌性大鼠 8只出现强烈求偶行为 对照組只口服生理盐水， 20只雄性大鼠和 10雌性大 鼠均未出现明显勃起和求偶行为 体内试验证明， 在给予本发明多肽的同时 同时给予促黑 激素 MC-3、 MC-4受体阻滞剂 SHU-9119后， 各受试大鼠均未出现明显勃起和求偶行为 这 说明本发明多肽可激活中枢促黑激素 MC-3、 MC-4受体， 并且是通过中枢促黑激素 MC-3、 MC-4 受体起作用的 其作用类似于天然神经递质。 由于其作用靶点是中枢神经系统勃起中 心 除生理作用外还有心理正反馈作用， 可同时用于惢理性和器质性男性勃起功能障碍的治 疗

[0036] 动物实验同时提示， 在有外界性刺激条件下 本发明多肽能唤醒性欲低下女性的性 欲， 并增加陰道壁血流 据统计性欲低下约发生于 30%的女性， 目前尚无有效药物对其进行 治疗 我们在动物实验中发现， 本发明多肽可选择性刺激性欲低下雌性大鼠的求偶行为 同 时发现， 阴道内温度升高 说明阴道血流增加， 这些证据表明黑色素能神经系统不仅调节男 性阴茎勃起和性欲 而且也调节女性的性欲， 是目前所知的唯一明确调节女性性欲的系统 也成为治疗女性性欲低下的希望。

[0037] 动物实验证明 多肽 5、 6 经口腔粘膜给药或多肽 1、 2 经注射给药， 都可抑制小鼠 的觅食行为 从而减轻小鼠的体重。 在 6只小鼠中 均有明显体重下降， 与对照组相比平均 丅降 5%; 对照组只口服生理盐水 各 6只小鼠未见明显体重下降。 体内试验证明 在给予 本发明多肽的同时， 同时给予促黑激素 MC-3、 MC-4受体阻滞剂 SHU9119后 受试小鼠未 见明显体重下降。 这说明本发明多肽能激活促黑激素 MC-3、 MC-4 受体 并是通过促黑激 素 MC-3、 MC-4受体起作用的， 其作用类似于天然神经递質

[0038] 动物实验证明， 多肽 3、 4、 5、 6 经皮肤给药或多肽 1、 2 经注射给药 都可刺激黑 色素的生成。 在受试牛蛙或大鼠中 与对照组相比， 皮肤黑喥提高许多； 对照组只给予生理 盐水 未见皮肤颜色加深。 这说明本发明多肽可激活促黑激素 MC-1受体 并是通过促黑激 素 MC-1受体发挥作用， 象忝然神经递质一样起到促进皮肤色素生成作用

[0039] 经大量动物实验表明， 在试验狗体内长期大剂量给药 未发现明显低血压， 也未发 现明显嘚肝脏及肾脏损害

[0040] 图 1为实施例 12的牛蛙试验结果， 其中 A为生理盐水对照组牛蛙； B为多肽 1试 验组牛蛙。

[0041] 以下实施例仅用于解释本发明 但鈈能由此限制本发明。

在氨基（NH₂) 型固相树脂上制备功能单位氨基酸序列

20%体积百分数的哌啶） 振荡反应 30分钟 抽出脱保护液， 用 DMF 洗涤树脂三佽 抽干， 取少许茚三酮检测 呈阳性。

[0043] 步骤 2、 依次向反应瓶中加入 50毫升 DMF, 三倍摩尔量 Fmoc-Trp-OH 三倍摩尔量 HBTU、 三倍摩尔量 NMM， 振荡反应 30分钟 取少许樹脂做茚三酮检测， 呈阴性 抽出反 应液， 再用 DMF振荡洗涤树脂三次 每次大约一分钟， 抽干 加 50 毫升脱保护液于树脂 中， 振荡反应 30 分钟 取少许树脂做茚三酮检测， 呈阳性 抽出脱保护液， 用 DMF振荡 洗涤树脂三次 抽干。

[0045] 步骤 4、 将已干燥的上步多肽树脂加入反应瓶中 再将已配制的 400 毫升 _ -

25度下反应 1小时， 反应结束后 用 DCM洗涤树脂三次， DMF振荡洗涤树脂 4次 再用

5 NMM/DMF反应液 （即 NMM/DMF混合液中含有 5%体积百分数的 NMM) 洗涤树脂三 次， 抽干 茚三酮检测呈阳性。 依次向反应瓶中加入 50毫升 DMF、 3.8克 HBTU、 1.1毫升

NMM, 振荡反应 1 小时 取少许树脂做茚三酮检测， 呈阴性 抽出反应液， 再用 DMF振 蕩洗涤树脂三次 甲醇洗涤树脂三次， 干燥 得到如下结构肽树脂：

步骤 5、 将上步多肽树脂按步骤 2中的脱保护方法脱除 N端 Arg上的 Fmoc保护基后制嘚含 功能单位氨基酸序列的肽树脂， 结构为：

将实施例 1制得的功能单位氨基酸序列多肽树脂按实施例 1中步骤 2的操作将生物素与其连 接 连接时间为 2小时， 无脱保护步骤 得到多肽树脂， 结构为：

[0047] 将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽 粗肽用高效液相色谱纯化 （色谱柱用 C-18, 洗 脱液鼡乙腈 /水 /1%TFA， 反相洗脱） 后 冻干制得多肽 1， 结构为：

[0049] 将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽 粗肽用高效液相色谱纯化 （色谱柱用 C-18, 洗 脱液用乙腈 /水 /1%TFA， 反相洗脱） 后 冻干制得多肽 3， 结构为：

[0051] 将上步树脂用三氟乙酸裂解得粗肽 粗肽用高效液相色谱纯化 （色谱柱用 C-18, 洗 脱液用乙腈 /水 /1%TFA， 反相洗脱） 后 冻干制得多肽 5， 结构为：

在羟基 (OH)型固相树脂上制备功能单位氨基酸序列

步骤 1、 精确称取 10克 （0.73毫摩尔 /克） 的 Fmoc-Lys(Mmt)-Wang Resin加入 200毫升的反 應瓶中 并加入 100毫升 DMF溶涨树脂 30分钟， 抽干 再用 DMF振荡洗涤树脂三次， 每 次 50毫升 2分钟一次， 抽干 加 50毫升脱保护试剂 （20%哌啶 /DMF， 即哌啶 /DMF混合 液中含有 20%体积百分数的哌啶） 振荡反应 30分钟 抽出脱保护液， 用 DMF洗涤树脂三 次 抽干， 取少许茚三酮检测 呈阳性。

[0053] 步骤 2、 依次向反应瓶Φ加入 50毫升 DMF, 三倍摩尔量 Fmoc-Trp-OH 三倍摩尔量 HBTU、 三倍摩尔量 NMM， 振荡反应 30分钟 取少许树脂做茚三酮检测， 呈阴性 抽出反 应液， 再用 DMF振荡洗涤树脂彡次 每次大约一分钟， 抽干 加 50 毫升脱保护液于树脂 中， 振荡反应 30 分钟 取少许树脂做茚三酮检测， 呈阳性 抽出脱保护液， 用 DMF振荡 洗滌树脂三次 抽干。

[0055] 步骤 4、 将已干燥的上步多肽树脂加入反应瓶中 再将已配制的 400 毫升 1 TFA/DCM反应液 （即 TFA/DCM混合液中含有 1%体积百分数的 TFA) 加入反应瓶Φ， 25度下反应 1小时 反应结束后， 用 DCM洗涤树脂三次 DMF振荡洗涤树脂 4次， 再用 5 NMM/DMF反应液 （即 NMM/DMF混合液中含有 5%体积百分数的 NMM) 洗涤树脂三 次 抽干， 茚三酮检测呈阳性 依次向反应瓶中加入 50毫升 DMF、 3.8克 HBTU、 1.1毫升 NMM, 振荡反应 1 小时， 取少许树脂做茚三酮检测 呈阴性， 抽出反应液 再用 DMF振 荡洗涤樹脂三次， 甲醇洗涤树脂三次 干燥， 得到如下结构肽树脂：

成年雄性及雌性 SD大鼠 重约 225克到 250克。 单个笼养 SPF伺养环境， 模拟自然白昼 及嫼夜光线 充足食物和水， 实验前给大鼠充足时间以适应环境 所有行为学研究都固定时 间完成 （14一 18点）。

口腔滴注本发明多肽 （实施例 4嘚多肽 5 ) 可诱发阴茎勃起

[0065] 实验发现经口腔滴注本发明多肽可诱发阴茎勃起。 口腔滴注不同剂量本发明多肽 5 (25 50， 100和 200纳克 /每克体重） 后 动物實验证明， 经口腔粘膜给药 功能单位氨基 酸序列与负载单位氨基酸序列相连的多肽可诱发大鼠阴茎勃起， 在剂量为 100 纳克 /每克体 重时 20只夶鼠中， 有 17只有阴茎勃起 11只有强烈阴茎勃起， 并有求偶行为 有勃起反 应持续时间为 30 分钟到 2 小时， 平均 60 分钟 （见表 1 ) 本实验设对照组， 為生理盐水 组 各 20只大鼠中， 未见明显阴茎勃起

[0066] 本发明多肽是通过中枢的 MC-3和 MC-4受体起作用。

[0067] SHU-9119可选择性的阻滞 MC-3和 MC-4受体 在我们的实验中应用夲发明多肽的 同时， 注射 SHU-9119 (剂量 2纳克 /每克体重） 结果发现， 本发明多肽 （剂量为 12.5,25,50, 和 100纳克 /每克体重） 无法诱导勃起 在 20只大鼠中， 只有在 100纳克 /每克体重时 2例 仍观察到轻度勃起。 说明本发明多肽是通过中枢的

注： 表中剤 单位为纳克海克 重 0表示生理盐水对照, 下同。

[0068] 采用同样的劑量和施用方法 用多肽 6代替多肽 5取得近似的实验结果 （见表 2)。

[0069] 采用同样的剂量、 注射给药的方式 用多肽 1 或多肽 2 也取得近似的实验结果 （见 表 3和 4)。 - 表 3、 注射给药本发明多廉 1可诱发阴荃勃起

表 4、 注射给药本发明多肱 2:可诱发阴荃勃起:

[0070] 结论： 本发明多肽是一种可经粘膜、 肌肉吸收进入血流的多肽， 动物实验证实其具 有引发男性阴茎勃起的功能 可用于治疗男性勃起功能障碍。

成年雄性及雌性 SD大鼠 重约 225克到 250克。 单个笼养 SPF伺养环境， 模拟自然白昼 及黑夜光线 充足食物和水， 实验前给大鼠充足时间以适应环境 所有行为学研究都固定时 间完成 （14一 18点）。

口腔滴注本发明多肽 （实施例 4的多肽 5) 可诱发雌性大鼠求偶行为

实验证明本发明多肽可使雌性大鼠发生求偶行为的改变 实验雌性大鼠在麻醉后行双侧卵巢 切除术后， 成为性欲低下型大鼠 实验中发现， 口腔滴注本发明多肽 5 ( 100 纳克 /每克体 重） 后 雌性大鼠进入雄性大鼠所在的上层的频率由平均 3次增加为 11 次， 首次进入上层 的时间由平均 11分钟减少为 3分钟 说明， 口腔滴注本发明多肽 5可刺激性欲低下的雌性 夶鼠的求偶行为 对阴道温度改变的观察中发现， 阴道内温度升高 说明阴道血流增加。 对 照生理盐水无以上作用

SHU-9119可选择性的阻滞 MC-3和 MC-4受體， 在我们的实验中应用本发明多肽的同时 注射 SHU-9119 (剂量 2纳克 /每克体重）， 结果发现 本发明多肽 （剂量为 12.5,25,50,和 100 纳克 /每克体重） 无法诱导明显求偶行为， 在 10只大鼠中 只有在 100纳克 /每克体重时， 2 例仍观察到轻度求偶行为 说明本发明多肽是通过中枢的 MC-3和

[0074] 采用同样的剂量、 同样的施鼡方法， 用多肽 6代替多肽 5取得近似的实验结果

[0075] 采用同样的剂量、 注射给药的方式， 用多肽 1或多肽 2也取得近似的实验结果

[0076] 结论： 本发明哆肽是一种可经粘膜、 肌肉吸收进入血流的多肽， 动物实验证实其具 有提高女性性欲的功能 可用于治疗女性性欲低下。 [0077] 实施例 11

成年雄性忣雌性昆明种小鼠 体重 30克左右， 分成若干组 每组 6只。 笼养 SPF伺养环 境， 模拟自然白昼及黑夜光线 充足食物和水， 实验前给小鼠充足時间以适应环境

肌肉注射本发明多肽 （实施例 2的多肽 1 ) 可抑制食欲

实验发现经肌肉注射本发明多肽可抑制食欲。 肌肉注射不同剂量本发明哆肽 1 ( 100纳克 /每 克体重） 后 动物实验证明， 经肌肉注射给药 功能单位氨基酸序列与生物素相连的多肽可 抑制小鼠食欲， 在剂量为 100纳克 /每克體重时 6只大鼠中平均体重比对照组下降 5%。 本 实验设对照组 为生理盐水组， 6只小鼠中 未见明显体重下降， 结果见表 5

SHU-9119可选择性的阻滞 MC-3囷 MC-4受体， 在我们的实验中应用本发明多肽的同时 注射 SHU-9119 (剂量 2纳克 /每克体重）， 结果发现 本发明多肽 （剂量为 100纳克 /每克体 重） 无法抑制食欲， 说明本发明多肽是通过中枢的 MC-3和 MC-4受体起作用

[0080] 用同样的剂量、 同样的施用方法用多肽 2 代替多肽 1 取得近似的实验结果 （见表 6)。

表 6、 肌肉往射本发明多服 可抑制小鼠食欲

[0081] 用同样的剂量、 口腔滴注的方式用多肽 5 或多肽 6 也取得近似的实验结果 （见表 7 和 8)。 - 表 7、 口腔滴注本发明哆胜 5可抑制小鼠食欲。

[0082] 结论： 本发明多肽是一种可经粘膜、 肌肉吸收进入血流的多肽 动物实验证实其具 有抑制食欲的作用， 可用于肥胖症的治疗

实验动物： 牛蛙。 将牛蛙在自然光线下照射一周 使其肤色均匀。

皮下注射本发明多肽 （实施例 2的多肽 1 ) 可促生黑色素

实验发现經皮下注射本发明多肽可促生黑色素 皮下注射不同剂量本发明多肽 1 (25， 50 100和 200纳克 /每克体重） 后， 动物实验证明 经皮下注射给药， 功能单位氨基酸序列与生 物素相连的多肽可促生黑色素 在剂量为 100 纳克 /每克体重时， 牛蛙可见皮肤颜色加深 对照组只注射生理盐水， 其牛蛙中 未见明显肤色变化 （见附图 1 )。 说明本发明多肽是通 过 MC-1受体起作用的

[0085] 用同样的剂量、 同样的施用方法用多肽 2代替多肽 1取得近似的实验结果。

[0086] 用 50毫克 /毫升溶液的剂量、 皮肤涂抹的方式 用多肽 5或多肽 6进行试验， 也取得 近似的实验结果

[0087] 结论： 本发明多肽是一种可经肌肉、 皮膚吸收进入血流的多肽， 动物实验证实其具 有促生黑色素的作用 可用于色素沉着不足和抗紫外线辐射治疗。

成年雄性及雌性 SD大鼠 重约 225克到 250克。 单个笼养 SPF伺养环境， 模拟自然白昼 及黑夜光线 充足食物和水， 实验前给大鼠充足时间以适应环境 所有行为学研究都固定时 間完成 （14一 18点）。

将大鼠腹部的毛用脱毛剂脱除 雌雄各 10只， 将本发明多肽 （实施例 3 的多肽 3 ) 用生理 盐水配成 50毫克 /毫升的溶液 每日三次涂抹腹部裸露皮肤处， 每次间隔 8小时 涂药 2小 时后可观察到雄性大鼠的阴茎勃起现象和雌性大鼠发情现象 （效果和多肽 5相近）； 经 7天 的连续給药， 可见大鼠腹部给药处皮肤变黑

[0090] 表 经皮给药本发明多肽 3可诱发雄鼠阴茎勃起， 雌鼠发情

剂量 50毫克 /毫升的溶液

注： 0表示生理盐水对照

[0091] 用多肽 4代替多肽 3后效果相似。

[0092] 表 经皮给药本发明多肽 4可诱发雄鼠阴茎勃起 雌鼠发情

剂量 50毫克 /毫升的溶液

注： 0表示生理盐水对照。

[0093] 结论： 本发明多肽是一种可经皮肤吸收进入血流的多肽 动物实验证实其具有促进 勃起和性欲、 促生黑色素的作用， 其作用于 MC-1、 MC-3、 MC-4受体

初步夶动物实验： 在对实验狗皮下大剂量 （200 微克 /每千克体重） 皮下注射本发明多肽 (实施例 3的多肽 5) 的实验。 注射后未见明显血压波动 肝肾功能指标正常， 反应症状包 括食欲降低 其中 2次注射后发生呕吐。 在用药后半年内观察无明显长期副作用

[0095] 根据动物实验， 建议剂量为每公斤體重 0.1毫克 建议剂型为水剂或油剂舌下含服， 也可制成粘膜吸入剂