78家实验室满分！全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测第二次室间质评结果发布
日，卫生部临床检验中心（NCCL）公布《2017 年全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测第二次室间质量评价（又称能力验证）》结果的总结。
全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价计划，是保证各临床实验室检测质量的重要手段。可以确定参评实验室肿瘤体细胞突变高通量测序检测的能力；发现在检测中存在的共性问题以及某些实验室存在的特殊问题，促进实验室提高检测水平。
2017年度，能力验证共有来自18个省（市、自治区）的共102个实验室参加肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质评活动。本次有91个实验室回报了结果。
预期结果：本次室间质量评价共检测6份样品，预期结果见下表
表： 2017年全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测第二次室间质量评价预期结果
评价原则：
1. 假阴性结果：在检测范围、检测限以上的基因突变均要求正确报告，未报告即为假阴性结果。一个假阴性结果，扣除20分。
2. 假阳性结果：预期结果以外的基因突变结果报告，均为假阳性结果。一个假阳性结果，扣除10分。
3. 错误结果的报告：实验室报告了预期结果内的基因突变，但存在以下错误情况：
A.突变位置相差1个碱基； B.1个碱基识别错误; C.其它。
错误A和B每个扣除5分。错误C每个扣除10分。
4. 填写不完整：例如，未写明氨基酸等。每个扣除5分。
5. PT成绩计算：所有错误结果累计扣分，满分100分。
得分大于等于90分则为合格；PT成绩小于90分为不合格。
PT成绩合格的实验室，融合基因需全部检测正确，融合基因检测成绩方为合格；否则仅点突变、短片段缺失和插入检测成绩合格。
本次质评中，实验室PT成绩情况如下：
至目前为止，我国已经开展了三次肿瘤体细胞突变高通量测序室间质量评价，分别为：2015年肿瘤体细胞突变高通量测序室间质量评价调查（合格率为51.2%，37/72；100%正确的实验室为16.7%，12/72），2017年第一次全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价（合格率为52.3%，48/92；100%正确的实验室为45.7%，42/92），2017年第二次全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价（合格率为89.0%，81/91；100%正确的实验室为85.7%，78/91）。可以看出，高通量测序实验室的检测成绩有了逐步地提高，假阴性和假阳性结果明显减少。本次假阴性结果主要来源于ERBB2缺失突变，以及PIK3CA c.1633G&A (p.Glu545Lys)和PIK3CA c.3140A&G (p.His1047Arg) 的漏检。出现错误的实验室应分析并查找原因。
室间质量评价不仅考核实验室的检测能力，同时也是对实验室检测标准化和规范化的教育过程。目前肿瘤体细胞突变高通量测序检测全部为实验室自建试剂方法（laboratory-developed tests, LDTs）。使用LDTs试剂的实验室需要首先建立试剂配制和使用的标准操作程序。NGS检测通常包括核酸提取、片段化、文库制备、加入标签、混样、测序、生物信息学分析和结果报告等步骤，NGS实验室会购买核酸提取试剂盒、文库制备试剂盒、通用测序反应试剂盒等，或者自行设计富集区域，合成相应的引物探针等，并且建立生物信息分析的流程；那么实验室相当于自行制备了一个试剂盒，因此对试剂盒中所有试剂原料的来源、试剂配制的过程、基因检测的区域、生物信息分析的软件、版本、分析流程以及结果报告解释等均需详细说明。临床实验室需建立自己的质量标准，例如覆盖深度（Depth of Coverage）、覆盖均一性（Uniformity of Coverage）、碱基识别质量值（Base Call Quality Scores）、比对质量值（Mapping Quality）等，并在每一批的检测过程中始终监测并记录，规定可接受的和不可接受的质量标准的值，不符合质量标准的结果为检测失败，同时建立检测失败的进一步处理方法。因此，在肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价中，各临床实验室在填写“全国肿瘤体细胞突变高通量测序检测室间质量评价测定结果回报表”中检测范围、检测流程、生物信息分析流程和结果报告解释等的过程，同时也是实验室的对照、检查标准操作程序是否包含相应关键点的过程，即室间质量评价的教育内容。
昨日，2017年全国肿瘤体细胞基因突变高通量测序检测生物信息学分析室间质评，以下为本次质评说明：
随着高通量测序技术的快速发展，高通量测序已由实验室研究逐步应用于临床，肿瘤基因突变的高通量测序对临床肿瘤患者的诊断、靶向治疗及预后判断具有重要指导意义。高通量测序检测过程可分为“实验室操作流程”（又称为“湿实验”）和“生物信息学分析流程”（又称为“干实验”）两个部分。“生物信息学分析”对于高通量测序检测结果的准确性与“实验操作”一样具有决定性意义。为了解我国肿瘤基因突变临床高通量测序实验室生物信息学分析能力的现状，卫生部临床检验中心（以下简称“临检中心”） 现开展该项目室间质量评价的预研。请各临床实验室使用日常所用程序进行分析。活动结束后，将向各参加实验室回报预期结果和质评小结，供实验室改善工作质量参考。并评价各参加实验室的检测成绩，发放相应证书。
一、活动流程
本次室间质评调查活动主要针对靶向测序数据的生物信息学分析。具体安排如下：
① 原始测序数据（FASTQ或BAM格式文件）下载：日至11月2日17:00（下载地址于10月30日8:00通过ncclmys公众号发布）。
② 靶向区域bed文件下载：日（下载地址于11月1日8:00通过ncclmys公众号发布）。
③ 结果回报：日17点前。注意：为保证及时回报结果,截止日期后收到的结果将不予统计分析。
④ 临检中心公布质评预期结果，各实验室根据预期结果核对分析错误原因并上报临检中心：时间待定。
⑤ 临检中心发布质评小结和相应证书：时间待定。
请各实验室关注临检中心临床免疫室微信公众号：ncclmys，后续通知将会通过ncclmys公众号发布，请及时查看。
二、样本信息
1.本次室间质评样本数据文件分三个测序平台：
①Illumina测序文件：Illumina HiSeq2500高通量测序平台的原始靶向测序数据，测序文件为FASTQ格式。使用的靶向测序panel为定制探针杂交捕获panel，靶向区域BED文件：Illumina_target.bed。
②Ion Torrent测序文件：Ion Torrent PGM高通量测序平台的原始靶向测序数据，测序文件为BAM格式。使用的靶向测序panel为Oncomine Comprehensive Assay 扩增子捕获panel；靶向区域BED文件：OCP_target.bed。
③ BGI-Seq500测序文件：BGI-Seq500高通量测序平台的原始靶向测序数据，测序文件为FASTQ格式。使用的靶向测序panel为定制探针杂交捕获panel，靶向区域BED文件：BGI_target.bed。
2. 各平台B号样本为肿瘤组织DNA高通量测序数据；B17NC 号样本代表临床上来自同一患者外周血或者正常组织样本中提取的基因组DNA样本数据。其中样本B均提供临床信息，请根据提供的临床信息对B号样本进行检测，并给出临床基因检测解读报告。
3. 具体样本信息见附件1。
三、样本处理方法
1．样本的发放：
为保证本次质评顺利开展，临检中心开通了2种数据传输方式（百度云盘和FTP客户端），希望各单位选择合适的下载方式，分流下载。
样本数据下载完成后请各实验室检查各样本编号及数量是否与活动安排相符并进行md5校验，如发现问题请立即与临检中心联系。
请各参加单位根据各自的报名情况自行选择不同测序平台数据下载，如报名参加多个测序平台的数据分析，请根据测序平台分别上报结果。
2．样本检测要求：
（1）根据上述提供的高通量测序数据，各实验室按照要求分别针对各测序平台对所接收的B号样本中肿瘤组织体细胞突变(somatic mutation)进行分析鉴定。注意：本次质评需根据中心提供的靶向测序panel中包含的基因范围（见BED文件）进行回报，即检测出测序panel中包含的所有体细胞突变(somatic mutation)；不接受实验室自定检测范围。
（2）本次质评样本可能包含的突变类型为单核苷酸变异（SNV），小的插入和缺失（Indel），拷贝数变异（CNV）以及基因重排（Rearrangement）即结构变异（SV）。各实验室需根据各自分析能力选择所分析的变异类型。
（3）因测序仪器及实验操作存在不同程度的背景噪音，因此本次质评需按照以下要求进行分析：
① Illumina测序文件的分析：需对突变频率VAF ≥ 1%且测序深度（Read depth）& 500X的位点进行回报。
② Ion torrent测序文件的分析：需对突变频率VAF ≥ 5%且测序深度（Read depth）& 500X的位点进行回报。
③ BGISeq500测序文件的分析：需对突变频率VAF ≥ 1%且测序深度（Read depth）& 500X的位点进行回报。
四、结果回报
1. 电子邮箱：请登录 ，密码：nccl123456 下载“2017年全国肿瘤体细胞基因突变检测生物信息分析室间质量评价结果回报表”的电子版，填写完整后，发送至。
2．本次室间质评调查活动中的专业问题可与临床免疫室联系：
电话：（010）
联系人：张瑞，李金明
卫生部临床检验中心
2017 年 10月
来源：卫生部临床检验中心
责任编辑：
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深度研究丨高通量DNA测序数据的生物信息学方法
詹晓娟1，姚登举2，朱怀球3
1. 黑龙江工程学院计算机科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150050；
2. 哈尔滨理工大学软件学院，黑龙江 哈尔滨 150040； 3. 北京大学生物医学工程系，北京 100871
摘要：高通量测序技术产生的DNA序列数据长度较短，而且数据量非常巨大。分析了高通量测序环境下大数据的挑战和机遇，总结并讨论了数据压缩、宏基因组数据序列拼接、宏基因组数据序列分析方面的算法和工具等研究成果。最后，展望了高通量测序下DNA短读序列数据研究的发展趋势。
关键词：高通量DNA测序；生物信息学；短读序列数据压缩；短读序列数据拼接；短读序列数据分析
中图分类号：TP399 文献标识码：A
doi: 10.11959/j.issn.16021
Bioinformatics methods for high-throughput DNA sequencing data
ZHAN Xiaojuan 1 , YAO Dengju 2 , ZHU Huaiqiu 3
1. College of Computer Science and Technology, Heilongjiang Institute of Technology, Harbin 150050, China
2. School of Software, Harbin University of Science and Technology, Harbin 150040, China
3. Department of Biomedical Engineering, Peking University, Beijing 100871, China
Abstract: DNA sequence data generated by high-throughput sequencing technology is short in length, and the amount of data is enormous. The challenges and opportunities of the big data in high-throughput sequencing environment were analyzed. The data compression, the assembly of metagenomic sequence data, and algorithms and tools of metagenomic sequence data analysis also were summarized and discussed. Finally, the future of the study on short read DNA sequence data in high-throughput sequencing environment was discussed.
Key words: high-throughput DNA sequencing, bioinformatics, short read sequence data compression, short read sequence data splicing, short read sequence data analysis
高通量测序技术又称“下一代”测序（next-generation sequencing， NGS）技术[1]，可以一次性测定几十万甚至几百万条序列，是现今应用最广泛的测序技术。相对于传统的Sanger测序技术[2]，NGS具有高速、高通量、低价格等优点[3]。高通量测序数据广泛应用于生物学、医学、遗传科学等诸多领域，具有重要研究价值。许多大型的科学研究项目，如千人基因组计划（1000genomeproject)、DNA元件百科全书（encyclopedia of DNA elements）计划、国际癌症基因组计划（international Cancer genome project）等，正以前所未有的速度产生海量DNA序列。截至2014年2月，仅登录在美国GenBank数据库中的DNA序列数据就有十万亿碱基对，所有高通量测序下的DNA短读序列数据大小达到上千PB。随着测序技术的不断改善和测序成本的持续降低，每天都会有海量的DNA序列产生，使得生物数据量呈指数规模增长，平均约每14个月增加一倍。图1对高通量测序平台下的短读（short reads，以下简称reads）序列数据和其他大数据领域的原始数据增长方式进行了比较，阴影区预报了未来的增长趋势，从图1可以看出，高通量测序下的基因组序列数据即短读序列数据的增长远大于摩尔定律的增长速度。计算机是存储和处理DNA数据的主要工具，其微处理器性能和存储设备容量平均18~24个月翻一番，而DNA测序数据平均4~5个月就翻一番，DNA测序数据的增长速度已经远远超过了计算机微处理器和存储设备的增长速度。面对如此迅速增长的庞大的短读序列数据集，如何有效管理、分析、充分利用这些信息，已成为生物信息学发展亟需解决的问题[4]。
图 1 不同种类数据的近似增长趋势
2 生物大数据带来的新挑战
随着高通量测序技术的发展，各种生物学数据呈现爆炸式增长，并且这一趋势将随着生物测序技术的发展而进一步增强。面对生命科学领域的大数据分析任务，多种不同维度的数据整合、多学科交叉的数据分析以及经典的数据挖掘算法都面临新的挑战。
2.1 多学科交叉的挑战
自从1990年人类基因组计划正式启动以来，20余年间，各种基因组、蛋白质组、转录组、宏基因组等国际生物学研究合作计划开始启动或已完成，目前国际上已经成立了多个大的跨国科研合作机构，生物信息领域的国际合作与交流也不断加强（见表1）。各种组学和生物信息学领域的国际化和跨学科间的专家合作使得团队成员在该领域取得了突出的成果，不仅发表了很多有影响力的文章，而且开发出许多新的数据集成和分析工具，以便资源和信息共享[5]。然而，面对飞速增长的生物学和日渐增多的生物信息学研究任务，跨学科的国际合作仍面临巨大的挑战，例如不同的实验室和平台产生的大数据如何实现无障碍的共享和协作分析，不同组学产生的数据如何有效地进行集成、管理、维护和更新，如何开发新型的面向生物学大数据分析的算法和工具等。
表 1 生物大数据项目合作计划
2.2 数据和工具的整合问题
目前主流的高通量测序平台主要有Roche/454焦磷酸测序、Solexa/Illumina边合成边测序和ABISOLiD连接测序。高通量测序技术的读长较短，但测序深度可以在一定程度上弥补读长较短带来的问题。其中，454测序平台读长最长有450~800bp，适合对未知基因组从头测序；Solexa/Illumina测序读长比454测序平台短，但测序通量高、价位低，适合基因组重测序；SOLiD读长也较短，但测序精度高，特别适合SNP检测等。目前应用较普遍的是Illumina测序平台，约占现有测序工具数量的一半。
不同的测序平台产生的数据格式各不相同，常用的文件格式有.bam、.csfasta、.fasta、.fastq、.gvf、.sam、.tar、.tiff、.var、.vcf等。现有的数据分析工具大多只能分析特定格式的数据，在实际的数据分析过程中往往需要把不同格式的数据进行标准化并重新整合，因此会浪费很多时间进行数据的预处理。例如，不同测序平台会产生不同品质和长度的高通量短读数据，由于没有统一的行业标准来描述高通量测序下的核苷酸序列和质量分数值，导致需要跨平台进行序列分析。因此，开发一组可以运行在不同计算平台下的互操作数据分析工具是一个具有挑战性的课题。
表2列出了目前高通量测序下各种组学所使用的工具和方法。随着这些多样的组学数据的整合，数据分析和解释的规模大大增加，这样就对基因组学和生命科学领域的大数据工具和基础设施提出更高的要求。对不同来源、不同形式的数据进行挖掘、评估、整合和应用还亟待加强。未来，多种组学数据的整合分析将会挑战传统的思维模式，发挥其至关重要的作用。
表 2 高通量测序下各种组学所使用的技术
2.3 构建新型学术交流平台日益迫切
随着高通量测序成本的降低，生物大数据对于传统的数据存储、分析和解释提出了新的挑战，而将这些数据和成果进行系统整合并应用于医疗实践才刚刚开始。当前，一些小的实验室显然不具备存储和处理大数据的基础设施和能力。随着互联网技术的快速发展，众多的科学合作网络平台提供了实时的数据交换，使得人们可以通过互联网方便地进行数据分享和成果交流。例如，Illumina公司的新一代测序云计算平台BaseSpace（www.basepace.com）、开放科学框架平台（http://openscienceframework.org）和Figshare（http://epic.org/privacy/medical）等。全球三大IT公司Amazon、Rackspace和Google都提供了云存储和计算解决方案，通过云计算平台可以实现大型数据中心的资源共享。然而，云计算基因组学也面临着数据隐私和病人数据的合法性问题，拓展新型的学术交流平台成为生物大数据研究的一个重要任务。
2.4 数据挖掘技术在生物大数据处理中的挑战
面对高通量测序数据的爆发式增长，传统的数据挖掘算法和工具遭遇巨大的挑战：如何建立智能学习数据库系统；如何对生物大数据存储访问和计算；如何进行隐私保护；如何结合领域知识设计新的适用于生物大数据挖掘分析的算法和工具。具体来说，面向生物学数据挖掘的数据挖掘技术主要有3个层次的挑战。第一个挑战是数据的访问和程序的运算。因为大数据都是分布式存储的，随着数据量的增长，如何建立一个有效的平台，使分散存储的数据能够摆脱计算机内存的限制和大数据处理的障碍，进行分布式计算。第二个挑战是不同的大数据有不同的语义和领域知识，如何能够更好地挖掘语义和领域知识，为数据所有者和消费者服务。第三个挑战集中在算法设计方面，生物大数据稀疏且具有各种各样的混合数据，数据有不确定性、不完整性和多源性等特点，如何用数据融合技术进行处理，并且挖掘出蕴含其中的复杂和动态信息；如何通过局部学习，得到一个反映全局问题的融合模型[17]。
3 高通量DNA测序数据的生物信息学方法
随着生物信息技术突飞猛进地发展，越来越多的计算机和数学领域的专家加入生物信息学研究的队伍，开发出许多好用的生物信息学工具，使得生物学、医学领域的专家可以利用这些先进工具对生物大数据进行分析，更准确地揭示生物进化的内部规律，更好地解释遗传变异，为基础医学研究向医学临床应用转化提供新思路和新方法，取得了非常有意义的成果。但是NGS测序的样本制备过程非常复杂，并且生成的序列难以处理，这给生物信息学专家带来了很大的挑战。
3.1 高通量DNA测序数据的压缩算法
NGS测序下的短读序列的数据量呈爆炸性增长，如果不对其进行压缩而直接存储或传输会消耗巨大的硬件存储设备，同时也会给网络传输带来很大的负担。NGS测序数据有其自身的特点和规律，存在大量的信息冗余，传统的数据压缩算法并不能够很好地压缩DNA序列，这就需要开发专门针对DNA序列的数据压缩算法和工具。
近几年，已经研发了许多专门针对NGS数据的压缩算法和工具，大多数是针对FASTQ格式的数据。根据DNA序列是否有参考基因组，压缩方法分为有参考基因组的压缩和无参考基因组的压缩。有参考基因组的数据压缩是利用参考基因组和短读序列的差异信息来进行压缩。这种方法第一步先把短读映射到参考基因组，记录每条短读在参考基因组上的位置以及与参考基因组的差异信息，然后再采用高效编码方式存储这些记录，实现数据压缩。其代表算法有DNAzip[18]、BWB[19]、SlimGene[20]、GRS[21]、mZIP[22]、NGC[23]、samcomp[24]等。由于同源物种基因组之间具有高度相似性，这种压缩通常能达到很高的压缩比，但这种方法有明显的局限性，有些测序数据（如宏基因数据、从头测序数据）并不存在现成的参考基因组，因此无法使用此算法；另外，该方法对于参考基因组依赖性太强，压缩和解压缩都需要相同参考基因组，这样参考基因组必须事先保存在本地，如果参考基因组缺失将直接影响压缩数据的使用。
无参考基因组的数据压缩方法通常采用两步法，首先最大限度地识别冗余DNA序列，然后再利用通用的压缩方法（如gzip、bzip2）进行处理。其代表算法工具有Beetl[25]、SCALCE[26]、SRComp[27]和ORCOM[28]。Beetl采用BurrowsWheeler变换算法，识别冗余；SCALCE采用局部一致性技术方法排序短读序列，识别关键子串；SRComp采用burstsort排序的方法，使相同的字符串聚集在一起，然后再采用不同的编码方式对其进行编码。ORCOM采用并行的Minimizers算法压缩reads中的重叠区域（overlap）。另一种新颖的无参考基因组的数据压缩方法是基于拼接的方法，代表算法有Quip[29]。Quip方法采用拼接的方式，用一小部分短读拼接成叠连群作为临时参考基因组，然后利用基于参考基因组的压缩方法进行压缩。
尽管高通量测序数据的压缩研究已取得一定成果，但其在计算资源、压缩算法方面仍面临巨大挑战。随着DNA测序数据量的增大，对计算资源的要求也越来越大，处理时间过长是DNA测序最重要的问题。另外，如何利用高通量测序技术产生有意义的冗余信息、采用并行化策略和基于索引的压缩方法、建立统一的数据质量评价标准等，都是重要的研究方向。
3.2 高通量DNA测序的序列拼接
由于测序技术的限制，新一代测序的读长较短（30~500bp）[30]，测序所得序列无法满足大多数序列分析的需要[31]，因此序列拼接成为基因组学研究中一个重要的环节。所谓序列拼接，是指将测序得到的短序列片段利用计算的方法拼接成较长的连续序列片段（contig）或者中间带有空隙的长序列片段（scaffold）乃至整段基因组序列的方法。
序列拼接包括两种不同的策略：从头（DeNovo）拼接的方法和对照（comparative）拼接的方法[32]。从头拼接是指在没有任何基因组序列参照的前提下，构建全新基因组序列的策略，而对照拼接是指在参照基因组序列的指导下进行的基因组序列的拼接。对照拼接适用于存在参照基因组序列的拼接，比如重测序项目中的序列拼接，而对于全新物种的大规模全基因组测序以及宏基因组测序项目主要使用从头拼接。
拼接算法的主要挑战来源于基因组中的重复序列片段。在不同区域的两个完全一致的重复片段无法通过计算的方式来辨别。对于相似但不完全一致的重复片段，可以通过提高序列比对的相似度阈值区分不同的复本，这种方法一般还涉及对reads中测序错误的估计[33]。重复片段的区分一般需要借助于reads或是mate-pair的跨越。所谓的mate-pair是指测序时从一段长度已知的片段两端测得的一对reads。对于reads来说，如果reads的中间是重复序列，而两端都有足够长的唯一片段，则可以区分中间的重复片段，这种方法针对短的重复片段有效，一般在k-mer图算法中使用。对于mate-pair来说，如果mate-pair分别处于重复序列的两端，也可以指导正确的拼接路径，而且mate-pair比reads更长，因此可以区分更长的重复片段。高的测序深度有利于重复片段的区分，因为高的测序深度可能提供更多的reads或者mate-pair跨越重复片段。对于新一代测序中短序列的拼接，重复片段的区分更加困难，因为reads更短，更多的重复片段无法通过reads来区分，因此提高测序深度和使用mate-pair尤为重要。
测序错误也给重复片段问题的解决增加了难度。因为拼接算法必须因为测序错误而接受不完全一致的重叠，以免错漏了真实的重叠。然而对测序错误的容忍又增加了拼接的假阳性。更多不完全一致的重复片段会对算法造成麻烦。另外，序列拼接需要考虑的一个问题是计算时间上的复杂度问题，尤其对于reads数量越来越多的大规模测序数据。例如，为了提高拼接效率，所有的拼接软件都在不同程度地以不同方式使用k-mer的概念。很直观的一个结论是，reads之间的重叠区域必然共同享有k-mer。而对共享k-mer的搜索显然要比计算序列比对简单得多。因此，几乎所有的拼接算法都涉及对k-mer的计算。
理论上，序列拼接属于一个NP难的问题，尚无一个盖棺定论的解答方法。现有的拼接算法只能通过一系列复杂的推断性质的步骤来获得近似的“解答”。这些算法仍有局限性，例如拼接结果错误、拼接序列连续性差、计算时间长、内存消耗量大等。因此，序列拼接算法仍有很大的改进空间。另外，测序技术的不断变化和改进，使得新数据对序列拼接不断提出新的要求，以更好地适应新数据的特点。
3.3 高通量测序下宏基因组的基因预测方法
基于高通量测序的宏基因组学研究给环境相关微生物的研究带来了新的机遇。随着越来越多的各种生态环境中宏基因组序列被测定并公开，有效的宏基因组数据分析和功能预测软件被开发与应用，这些都大大推动了宏基因组学的发展。目前研究基因预测的方法主要有两类：一类是基于序列相似性的预测方法，基于已知的基因序列通过搜索相似度较高的序列进行预测；另一类是基于统计学模型的预测方法，即利用数学统计模型进行基因预测，从已知的DNA序列中训练出统计学模型，应用到宏基因组的测序结果上进行预测。
（1）基于序列相似性比较的方法
序列比对是生物信息学的基础，其基本问题是比较两个或两个以上序列之间的相似性。两个序列比对已有发展成熟的动态规划（dynamic programming）算法和在此基础上发展起来的工具包BLAST[34]和FASTA[35]。事实上，在基于比对的方法中，高通量测序所得的序列较短，而这种短序列直接进行比对的效果往往不理想，并且大量的原始数据进行比对会耗费很多时间，因此需要在比对前进行序列拼接，将其拼接成较长的序列，提高分析效率和分析效果[36]。由于必须与已知基因序列进行相似性比较，故这种方法很难发现新基因。
基于序列相似性比较的高通量测序的宏基因组数据的应用非常多。2010年，华大基因在Nature发表文章，对人体肠道微生物基因组研究计划（MetaHIT）进行了总结[37]。该计划为研究人体肠道微生物群落与人类健康之间的关系，采集了124个欧洲人的粪便样本，其中包括25个炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）患者和99个健康志愿者的样本，并用Illumina测序平台进行测序，产生了567.7GB的测序数据，并对序列拼接、注释、功能基因的分类、多态性分析等进行了研究。2012年，华大基因在Nature发表了一篇研究人体肠道微生物与Ⅱ型糖尿病之间关系的文章[38]。该研究收集了345个中国人的肠道微生物样本，用Illumina测序平台对其进行了深度测序，并在基因组关联研究（genome wide association studies，GWAS）的基础上开发了一种全基因组相关联研究（meta genome wide association studies，MGWAS）的方法，对Ⅱ型糖尿病与肠道微生物失调之间的关系进行了深入研究。人体肠道中绝大多数种类的微生物是难以培养的，只有运用宏基因组学技术才能研究人类肠道中的所有微生物群落，进而了解人类肠道中细菌的物种分布。
（2）基于序列内容统计特征的方法
基于序列内容统计特征的基因预测方法一般是建立在密码子的编码区和非编码区有不同相对出现频率的基础上的。除了一个区域碱基组成的特征外，基因长度分布、CG含量、基因重叠区域的特征等因素也常被用于基因预测中。根据DNA序列中编码蛋白质区域和非编码区域内容统计特征的差别，建立其学习模型，可以有效地进行基因预测。在单个基因组上具有代表性的方法包括采用马尔科夫模型的GeneMark[39-41]系列、Glimmer[42,43]系列、FGENESB[44]和MED[45,46]系列。GeneMark对原核生物、真核生物和病毒均能进行基因预测。Glimmer被广泛应用于微生物的基因预测。FGENESB主要用于细菌基因组的基因自动预测和注释。MED是笔者所在课题组开发的一款基于多元熵距离法的原核生物基因预测算法，该算法的基础为开放阅读框（ORF）和翻译起始位点（TIS）的综合统计模型。MED2.0在对DNA的GC核苷酸含量高的细菌基因组和古细菌基因组的基因预测上具有明显优势，之后又推出了MED2.1，提高了预测精度，达到了国际水平。
针对宏基因组序列的研究，研究人员开发了一系列宏基因组预测算法（见表3）。宏基因组预测算法借鉴了传统的基于单基因组的基因预测方法，只是对原始数据增加了预处理的步骤。例如，MetaGUN算法基于序列组成的统计特征对输入序列进行分类，对同一类中的序列使用相同的统计模型刻画，然后分别独立地进行基因预测，在模拟宏基因序列测试集和在两个人体肠道微生物的真实数据上的测试表明，MetaGUN在发现新基因方面更具潜力。MetaGeneMark同时使用细菌—古细菌和嗜温细菌—嗜热细菌两套模型进行预测。FragGeneScan适用于有测序错误的宏基因组序列。
表 3 宏基因组基因预测算法
近年来，专门针对宏基因组序列的基因预测方法目前面临着新的挑战，基于序列相似性比较的方法，使用BLAST系统工具对已知数据库进行相似性搜索，依赖性强，无法发现新基因。基于统计建模的预测算法运行速度快，在保证高特异性的条件下能获得更高的敏感性。宏基因组序列来源于繁杂且大多为未知的物种，微生物中已知的细菌和古细菌只占全世界存在量的10%；同时高通量测序的宏基因组DNA序列很短，存在大量不完整基因，无法在单个序列片断上完成自学习，为统计建模所能提供的信息有限；另外，如何把分析结果和已知的数据库（Greengenes[55]、SILVA[56]等）结合起来、如何进一步研究生物体之间以及生物体和环境之间的相互作用等，都成为亟待解决的问题。
高通量测序技术奠定了生物信息学的“大数据”基础，面对如潮水般的基因序列数据，给后续基因组分析方法的研究和工具的发展带来了巨大挑战。本文总结讨论了高通量测序数据的基因组分析及生物信息学方法。目前，基因组生物信息学研究正面临从传统的全基因组序列分析到当前基于短读的序列片段（含contigs）分析；从传统的单个物种的全基因组序列分析到当前多个物种混杂的序列片段数据集的分析；从本地计算机运算分析到未来适应“云计算”模式的远程、快速运算分析这几方面发展。面对如此快速的发展，现有的生物信息学方法和工具已经不能满足如此大量的数据资料的需求，只有进一步发展出优秀的生物信息学方法和工具，才能更好地利用高通量测序技术的优势和应用价值。
作者简介：
詹晓娟（1978-），女，黑龙江工程学院讲师，主要研究方向为数据挖掘、机器学习、生物信息。
姚登举（1980-），男，哈尔滨理工大学副教授，主要研究方向为数据挖掘、机器学习、生物信息。
朱怀球（1970-），男，北京大学教授，主要研究方向为生物医学信息学和计算系统生物学。
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责任编辑：王培
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