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······高效液相色谱法
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目录1 拼音gāo xiào yè xiàng sè pǔ fǎ2 英文参考high performance liquid chromatography[WS/T 455—2014 卫生监测与评价名词术语]HPLC[WS/T 455—2014 卫生监测与评价名词术语]high efficiency liquid chromatography[湘雅医学专业词典]high-efficiency liquid chromatography[湘雅医学专业词典]3 高效液相色谱法的定义高效液相色谱法是指具有高效能的柱。高效液相色谱法系采用高压将的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱。注入的供试品，由流动相带入柱内，各组分在柱内被分离，并依次进入器，由积分仪或数据处理记录和处理色谱信号。
4 对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱法所用的仪器为高效液相色谱仪。仪器应定期检定并符合有关规定。4.1 色谱柱反相色谱系统使用非极性填充剂，常用的色谱柱填充剂为合硅胶，以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基硅烷键合硅胶和其他类型的硅烷键合硅胶（如氰基键合硅烷和键合硅烷等）也有使用。正相色谱系统使用极性填充剂，常用的填充剂有硅胶等。系统使用交换填充剂；排阻色谱系统使用或多孔微球等填充剂；对映异构体的分离通常使用手性填充剂。填充剂的（如的、粒径、孔径、表、键合基团的表面覆盖度、含碳量和键合类型等）以及色谱柱的填充，直接影响供试品的保留和分离效果。分子量小于2000的应选择孔径在15nm（1nm=10A）以下的填料，分析分子量大于2000的化合物则应选择孔径在30nm以上的填料。除另有规定外，普通分析柱的填充剂粒径一般在3～10μm之间，粒径更小（约2μm）的填充剂常用于填装微径柱（内径约2mm）。使用微径柱时，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也需作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以项下规定的色谱条件的测定结果为准。以硅胶为载体的键合固定相的使用温度通常不超过40℃，为改善分离效果可适当提高色谱柱的使用温度，但不宜超过60℃。流动相的应在2～8之间。当pH值大于8时，可使载体硅胶；当pH值小于2时，与硅胶相连的化学键合相易水解脱落。当色谱系统中需使用pH值大于8的流动相时，应选用耐碱的填充剂，如采用高纯硅胶为载体并具有高表面覆盖度的键合硅胶填充剂、包覆聚合物填充剂、有机一无机杂化填充剂或非硅胶基键合填充剂等；当需使用pH值小于2的流动相时，应选用耐酸的填充剂，如具有大体积侧链能产生空间位阻保护的二异丙基或二异丁基取代十八烷基硅烷键合硅胶填充剂、有机－无机杂化填充剂等。
4.2 检测器最常用的检测器为紫外检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有检测器、光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。紫外、荧光、电化学检测器为选择性检测器，其响应值不仅与供试品有关，还与化合物的有关；蒸发光散射检测器和示差折光检测器为通用型检测器，对所有的化合物均有响应；蒸发光散射检测器对结构类似的化合物，其响应值几乎仅与供试品的质量有关；二极管阵列检测器可以同时记录供试品的，故可用于供试品的光谱和色谱峰的纯度。紫外、荧光、电化学和示差折光检测器的响应值与供试品溶液的浓度在一定范围内呈，但蒸发光散射检测器的响应值与供试品溶液的浓度通常呈指数关系，故进行计算时，一般需经对数。不同的检测器，对流动相的要求不同。如采用紫外检测器，所用流动相应符合紫外－可见（A）项下对的要求；采用低波长检测时，还应考虑有机相中的截止使用波长，并选用色谱级有机溶剂。蒸发光散射检测器和质谱检测器通常不允许使用含不性盐组分的流动相。4.3 流动相反相色谱系统的流动相首选－水系统（采用紫外末端波长检测时，首选－水系统），如经试用不适合时，再选用其他溶剂系统。应尽可能少用含有的流动相，必须使用时，应尽可能选用含较低浓度缓冲液的流动相。由于C18链在水相中不易伸展状态，故对于十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的反相色谱系统，流动相中有机溶剂的比例通常应不低于5%，否则C18链的卷曲将导致组分保留值变化，造成色谱系统不。各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的等，均可适当改变，以供试品并达到系统适用性试验的要求。其中，调整流动相组分比例时，以组分比例较低者（小于或等于50%）相对于自身的改不超过±30%且相对于总量的改变量不超过±10%为限，如30%相对改变量的超过总量的10%时，则改变量以总量的±10%为限。对于必须使用特定牌号的填充剂方能满足分离要求的品种，可在该品种项下注明。
5 系统适用性试验高效液相色谱法的适用性试验通常包括理论板数、分离度、和拖尾因子等四个参数。其中，分离度和重复性尤为重要。按各品种项下要求对色谱系统进行适用性试验，即用规定的对照品或系统适用性试验溶液在规定的色谱系统进行试验，必要时，可对色谱系统进行适当调整，以符合要求。5.1 色谱柱的理论板数（n）用于评价色谱柱的分离效能。由于不同物质在同一色谱柱上的色谱行为不同，采用理论板数作为衡量柱效能的指标时，明测定物质，一般为待测组分或内标物质的理论板数。在规定的色谱条件下，注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液，记录色谱图，量出供试品主成分峰或内标物质峰的保留时间tR（以分钟或长度计，下同，但应取相同单位）和峰宽（W）或半高峰宽（Wh/2），按n=16（tR/W）2或n=5.54（tR/Wh/2）2计算色谱柱的理论板数。5.2 分离度（R）用于评价待测组分与相邻共存物或难分离物质之间的分离程度，是衡量色谱系统效能的关键指标。可以通过测定待测物质与已知杂质的分离度，也可以通过测定待测组分与某一添加的指标性成分（内标物质或其他难分离物质）的分离度，或将供试品或对照品用适当的方法降解，通过测定待测组分与某一降解产物的分离度，对色谱系统进行评价与控制。无论是鉴别还是，均要求待测峰与其他峰、内标峰或特定的杂质对照峰之间有较好的分离度。除另有规定外，待测组分与相邻共存物之间的分离度应大于1.5。分离度的计算公式为：式中tR2为相邻两峰中后一峰的保留时间；tR1为相邻两峰中前一峰的保留时间；W1、W2及W1,h/2、W2,h/2分别为此相邻两峰的峰宽及半高峰宽（如图）。当对测定结果有异议时，色谱柱的理论板数（n）和分离度（R）均以峰宽（W）的计算结果为准。5.3 重复性用于评价连续进样中，色谱系统响应值的重复性能。采用外标，通常取各品种项下的对照品溶液，连续进样5次，除另有规定外，其峰面积值的相对标准偏差应不大于2.0%；采用内标法时，通常配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加入规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子。其相对标准偏差应不大于2.0%。
5.4 拖尾因子（T）用于评价色谱峰的对称性。为保证分离效果和测量精度，应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。拖尾因子计算公式为：式中W0.05h为5%峰高处的峰宽；d1为峰顶点至峰前沿之间的距离（如图）。除另有规定外，峰高法定量时T应在0.95～1.05之间。峰面积法测定时，若拖尾严重，将影响峰面积的准确测量。必要时，应在各品种项下对拖尾因子作出规定。6 测定法6.1 内标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和内标物质，分别配成溶液，精密量取各适量，混合配成校正因子测定用的对照溶液。取一定量注入仪器，记录色谱图。测量对照品和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算校正因子：式中&AS为内标物质的峰面积或峰高；AR为对照品的峰面积或峰高；cS为内标物质的浓度；cR为对照品的浓度。再取各品种项下含有内标物质的供试品溶液，注入仪器，记录色谱图，测量供试品中待测成分和内标物质的峰面积或峰高，按下式计算含量：式中AX为供试品的峰面积或峰高；cX为供试品的浓度；A'X为内标物质的峰面积或峰高；c'S为内标物质的浓度；f为校正因子。采用内标法，可避免因前处理及进样体积对测定结果的影响。6.2 外标法按各品种项下的规定，精密称（量）取对照品和供试品，配制成溶液，分别精密取一定量，注入仪器，记录色谱图，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积（或峰高），按下式计算含量：式中各符号意义同上。由于微量不易精确控制进样量，当采用外标法测定供试品中成分或杂质含量时，以定量环或自动进样器进样为好。6.3 加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，可采用加校正因子的主成分自身对照法。在建立方法时，按各品种项下的规定，精密称（量）取杂质对照品和待测成分对照品各适量，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，记录色谱图，按上述（1）法计算杂质的校正因子。此校正因子可直接载入各品种项下，用于校正杂质的实测峰面积。这些需作校正计算的杂质，通常以主成分为参照，采用相对保留时间定位，其数值一并载入各品种项下。测定杂质含量时，按各品种项下规定的杂质限度，将供试品溶液稀释成与杂质限度相当的溶液作为对照溶液，进样，调节检测灵敏度（以水平可接受为限）或进样量（以柱子不过载为限），使对照溶液的主成分色谱峰的峰高约达满量程的10%～25%或其峰面积能准确积分[通常含量低于0.5%的杂质，峰面积的相对标准偏差（RSD）应小于10%;含量在0.5%～2%的杂质，峰面积的RSD应小于5%;含量大于2%的杂质，峰面积的RSD应小于2%]。，取供试品溶液和对照品溶液适量，分别进样，供试品溶液的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积，分别乘以相应的校正因子后与对照溶液主成分的峰面积，依法计算各杂质含量。
6.4 不加校正因子的主成分自身对照法测定杂质含量时，若没有杂质对照品，也可采用不加校正因子的主成分自身对照法。同上述（3）法配制对照溶液并调节检测灵敏度后，取供试品溶液和对照溶液适量，分别进样，前者的记录时间，除另有规定外，应为主成分色谱峰保留时间的2倍，测量供试品溶液色谱图上各杂质的峰面积并与对照溶液主成分的峰面积比较，计算杂质含量。若供试品所含的部分杂质未与溶剂峰完全分离，则按规定先记录供试品溶液的色谱图Ⅰ，再记录等体积纯溶剂的色谱图Ⅱ。色谱图Ⅰ上杂质峰的总面积（包括溶剂峰），减去色谱图Ⅱ上的溶剂峰面积，即为总杂质峰的校正面积。然后依法计算。6.5 面积归一化法按各品种项下的规定，配制供试品溶液，取一定量注入仪器，记录色谱图。测量各峰的面积和色谱图上除溶剂峰以外的总色谱峰面积，计算各峰面积占总峰面积的百分率。用于杂质检查时，由于峰面积归一化法测定误差大，因此，通常只用于粗略考查供试品中的杂质含量。除另有规定外，一般不宜用于微量杂质的检查。7 参考资料 [1] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.WS/T 455—2014 卫生监测与评价名词术语[Z].. [2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版：二部[M].北京：中国医药科技出版社，2010. 相关文献
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编辑QQ群：8511895 （不接受疾病咨询）　　摘要 高效液相色谱结合了液相色谱法和气相色谱法的分析分离原理，具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高和应用范围广等优点，" />
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高效液相色谱法在药物分析中的应用
2014年7期目录
&&&&&&本期共收录文章20篇
　　摘要 高效液相色谱结合了液相色谱法和气相色谱法的分析分离原理，具有分离效能高、分析速度快、灵敏度高和应用范围广等优点，本文主要介绍了离子色谱法、反相高效液相色谱法、超高效液相色谱法及高效液相色谱联用在药物研究分析领域中的应用。 中国论文网 /8/view-6214719.htm　　关键字 HPLC；药物；分析 　　中图分类号R9 文献标识码A 文章编号 （82-02 　　高效液相色谱法是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种快速、高效的新型分离分析技术。，并且可以直接用于分析难挥发、热不稳定及高分子样品，弥补了气相色谱法的弱点，扩大了色谱法的应用范围，高效液相色谱法包括吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法和分子排阻色谱法，其中基于分配机理的高效液相色谱法在药品检验中应用非常广泛的一种仪器分析方法。 　　1离子色谱法在药物分析中的应用 　　离子色谱法是美国 Small等人在离子交换色谱法的基础上建立起来的一种离子分离分析液相色谱技术，以其灵敏、快速、精密度高、抗干扰能力强等优点，主要应用于药物及合成中间体的分析、复杂组分中的某一组分鉴定、药物离子的价态及形态分析等方面。 　　晏菊姣等建立了离子色谱法测定注射用头孢他啶中碳酸钠的含量，钠离子浓度在2mg/L~20mg/L范围内呈良好的线性关系（r=0.9992），平均回收率为100.6% （n=9），测得定量限为0.002mg/L，该方法采用 Ionpac CG12A，CS12A阳离子交换柱，淋洗液为18mmoL/L 甲烷磺酸，CSRS-ULTRA 4mm自动抑制循环模式，抑制电流为60mA。 　　张伟等采用高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量，采用 IonPac AS11-HC离子交换柱（4mm×250mm），流动相为20mmol/L的 NaOH 溶液，等度洗脱 20min，采用 ASRS 4mm阴离子抑制器，电导检测器，测得枸橼酸离子浓度在 0.1～2.0μg/mL范围内，对照品色谱峰面积与枸橼酸离子浓度呈良好的线性关系，r=0.9990，总平均回收率 97.80%，RSD为0.69%，该方法的检测限为 0.01μg/mL，弥补了《中国药典》三部（2010版）中规定方法的不足之处。 　　2反相高效色谱法在药物分析中的应用 　　反相高效色谱法是指流动相极性大于固定相极性的分配色谱法，适用于分离非极性至中等极性的各类分子型物质，应用范围也比正相色谱法更广泛。 　　陈德志等建立同时测定咪达唑仑、硝西泮、地西泮3种药物血药浓度的反相高效液相色谱法，色谱柱为 Symmetry shield RP18 柱（250mm×4.6mm，5.0μm），流动相为甲醇 - 磷酸盐缓冲液（55:45，v/v，pH2.15），咪达唑仑、硝西泮、地西泮质量浓度在 20-4000ng/mL范围内与峰面积呈良好线性关系（r≥0.9996，n=5），回收率98.2%～103.9%之间。 　　翁水旺等建立反相高效液相色谱法分离测定奥美拉唑肠溶胶囊的含量及有关物质的方法，采用 VARIAN C18（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱，以甲醇 - 水 - 三乙胺 - 磷酸（67:33:0.3:0.12）为流动相，检测波长为302nm，测得奥美拉唑在浓度4.0μg/ml~40.0μg/ml范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.99999，平均回收率为100.3%，RSD为 0.17%。 　　钟延霞等建立了反相高效液相色谱法测定吉非替尼的方法，采用Hypersil BDS C18-5μm（250mm×4.6mm）色谱柱，流动相为乙腈-0.15%三氟乙酸（体积比为2∶8），紫外检测波长254nm，吉非替尼的质量为6.824 0μg~34.1200μg时线性关系良好，线性系数为0.99908，加标回收率大于95%，检测底限为20.7248μg。 　　赵军等建立了反相高效液相色谱法同时分离测定6种临床最常用的头孢菌素(头孢他啶、头孢拉定、头孢氨苄、头孢哌酮、头孢唑林、头孢噻肟)，采用SHIM-PACK VP-ODS色谱柱，以乙腈及0.05mol/L HAC-NaAC缓冲溶液（pH=4.0）组成流动相梯度淋洗，在15min内分离并测定了上述 6 种头孢菌素，6种药物最低检出限均可达到 0.20μg/mL。 　　3 超高效液相色谱在药物分析中的应用 　　超高效液相色谱系指一种采用小颗粒填料色谱柱（粒径小于2 μｍ）和超高压系统（压力大于105 kPa）的新型液相色谱技术，能显著改善色谱峰的分离度和检测灵敏度，同时大大缩短分析周期，其较大的峰容量和更高的灵敏度更适于中药中多成分的分析。 　　唐军等建立了一种快速测定血栓通注射液中5种皂苷成分（三七皂苷R1及人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rd）含量的方法，应用新型的超高效液相色谱系统，使用1.7μm填料的BEH C18色谱柱（50mm×2.1mm），乙腈-水两相溶剂梯度洗脱，5种皂苷成分在测定的浓度范围内线性关系良好，r＞0.9984，RSD小于3.1%，最低定量限和最低检测限可分别达到0.5ng和0.2ng，平均回收率均大于95.0%。 　　4 高效液相色谱联用在药物分析中的应用 　　胡晓玲等建立超高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS）测定健康人血浆中阿托伐他汀浓度，阿托伐他汀浓度在0.385ng/mL~15.400ng/mL线性关系良好，相关系数达0.9974，日内、日间RSD符合方法学要求。 　　陈吉汉等建立了超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS）测定鸡肉与鸡蛋中 6种他汀类药物残留量。色谱柱为BEH C18，以甲醇-0.1% 甲酸 5mmol 乙酸铵为流动相，梯度洗脱分离，6 种他汀类药物在 1.0～100μg/kg浓度范围内线性良好，r＞0.9910，检出限和定量限分别为 0.1～0.5μg/kg和0.3μg/kg~2.0μg/kg。 　　王映红等应用高效液相-核磁共振联用技术（LC-NMR）对微量级蛇葡萄根提取物中混合物的各个组分进行分离，并获得1H NMR及COSY谱，通过与此类化合物所建立的氢谱数据库进行比较分析，确定了微克级的天然产物混合物中的主要组分的化学结构及立体结构，使微量天然混合物中的主要组分的化学结构及立体结构得到证实，充分体现了LC-NMR技术的微量、快速的特点。 　　5 结论 　　高效液相色谱法选择性高、灵敏度高、分析速度快，并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点，成为医药研究的有力工具，在天然药物及复方成药分析，抗生素分析，手性药物分析，临床治疗药物检测等领域均需用到HPLC的不同测定方法。 　　 　　参考文献 　　[1]吴燕，米亚娴.离子色谱法及其在药物分析中的应用. 天津药学):50-52. 　　[2]晏菊姣，付丽娟.离子色谱法测定注射用头孢他啶中碳酸钠的含量.药物分析杂志，):. 　　[3] 张伟，任连杰，张彤，等.高效阴离子交换色谱法测定人凝血因子Ⅷ中枸橼酸离子的含量.中国生物制品学杂志， ):125-128. 　　[4]陈德志，陈巧辉，陈翠萌等.反相高效液相色谱法同时，测定3种抗癫痫药物的血药浓度.中国药业，):7-8. 　　[5]翁水旺，柯明容.反相高效液相色谱法测定奥美拉唑肠溶胶囊含量及有关物质.食品与药品，A):49-51. 　　[6]钟延霞，陈艳雪，王宝君，等.反相高效液相色谱法测定吉非替尼的含量.河北师范大学学报，):454-458. 　　[6]赵军，朱晨，韩玲，等.反相高效液相色谱法同时分离和测定多种头孢菌素.山东大学学报，):145-151. 　　[7]郝桂明，唐素芳.超高效液相色谱在药物分析中的应用.天津药学，):64-69. 　　[8]唐军，武为宝.超高效液相色谱法快速测定血栓通注射液中5种皂昔成分的含量.药物分析杂志，):97-99. 　　[9]胡晓玲，李焕德.UPLC-MS-MS法测定健康人血浆中阿托伐他汀浓度及药物代谢动力学研究.中南药学，2008， 6(4):400-403. 　　[10]陈吉汉，路勇，姜洁，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡肉与鸡蛋中6种他汀类药物残留.分析化学，2014， 42(2):209-214. 　　[11]王映红，李娜，贺文义.高效液相色谱―核磁共振联用技术在蛇葡萄根提取混合物中的应用研究.波谱学杂志，):229-234.
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