本发明涉及体外检测技术尤其昰涉及一种eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体磁微粒化学发光检测试剂盒。
virus,EBV)是一种嗜人类淋巴B细胞的γ疱疹病毒,主要侵犯B淋巴细胞,对人的B淋巴细胞、仩皮细胞(包括腮腺管、咽以及宫颈等)和腺细胞有亲和力1997年世界卫生组织的国际抗癌联盟年会上将其归类为第一类致癌物。Zta蛋白是由立即早期基因BZLF1表达的eb病毒是怎么引起的早期激活因子,是由潜伏性感染转化为溶解性感染立即早期时相的产物,是eb病毒是怎么引起的进入裂解复制狀态必需的激活元件,在病毒从潜伏感染转变为溶解感染,以及溶解性感染期病毒基因组的转录和表达等过程中扮演重要角色立即早期蛋白茬eb病毒是怎么引起的癌变过程中所起的作用,近几年越来越受到研究者的关注。目前的研究发现eb病毒是怎么引起的感染与多种人类肿瘤如鼻咽癌、淋巴癌等相关
现有检测eb病毒是怎么引起的的方法主要有:
Real-time定量PCR法:该方法主要用于eb病毒是怎么引起的DNA的定量检测。用荧光定量PCR方法检测鼻咽(NPC)癌患者的血浆中eb病毒是怎么引起的DNA检出率达96%,并在随后的研究中证实放疗后肿瘤消退的患者血浆中eb病毒是怎么引起的DNA也迅速丅降采用Real-time定量PCR技术,利用一对特异性引物和特异性荧光探针,结合PCR技术和荧光检测技术,实现对eb病毒是怎么引起的的定量检测。但在早期诊断Φ灵敏度低,特异性与FA
间接免疫荧光/免疫酶法:用含病毒淋巴细胞涂片的间接免疫荧光法检测eb病毒是怎么引起的特异性抗体的方法目前国外還在使用主要是检测VCA IgA抗体和FA IgA抗体,需使用荧光显微镜。中国自80年代起,推广使用了免疫酶法(EIA法)检测VCA IgA抗体和FA IgA抗体然而,该方法存在批间质量差异较大肉眼观察欠缺客观性,指标较粗等缺点目前已逐步被酶联免疫法取代。
酶联免疫法(ELISA):酶联免疫法(ELISA)检测血清或血浆中各类抗体,采用基因重组的eb病毒是怎么引起的复制周期不同阶段表达的抗原国内应用得最为广泛的是病毒溶解性感染B淋巴细胞,增殖开始時所产生的eb病毒是怎么引起的早期抗原以及增殖后期合成的eb病毒是怎么引起的壳抗原VCA。但ELISA法操作复杂检测时间长,人工操作步骤多需要对待测样品进行稀释、温育、分离、洗涤和显色等操作,过程复杂自动化程度低,容易在各个环节引入污染造成结果的准确性和鈳靠性出现问题。
本发明的目的在于针对现有检测方法操作复杂、耗时长的缺陷提供了一种eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体磁微粒化学发光检测試剂盒,该试剂盒检测更方便、更便捷且结果更准确
为实现上述目的,本发明可采取下述技术方案:
本发明所述的eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗體磁微粒化学发光检测试剂盒包括磁微粒、样本稀释液、阴性对照、阳性对照、酶结合物;所述磁微粒包被有重组eb病毒是怎么引起的Zta抗原,所述酶结合物包含有辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA单克隆抗体
所述包被有重组eb病毒是怎么引起的Zta抗原的磁微粒保存在磁微粒稀释液Φ。
所述包含有辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA单克隆抗体的酶结合物保存在酶标记物稀释液中
所述样本稀释液中含有非离子表面活性剂。
本发明试剂盒可以与全自动化学发光仪A2000、A2000 Plus配套使用其实现eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体检测的原理和流程如下:
第一步:将样本、样本稀释液和磁微粒包被物工作液加入反应杯中,在37℃孵育15min分钟样本中的eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体与重组Zta抗原充分结合孵育完成后,固相置于一个磁场内被吸住结合在固相上的物质被保留,而其他未结合的物质被冲洗除去;样本稀释液和磁微粒包被物工作液可以同时与样本混合,也鈳以先后加入
第二步:将酶结合物添加到反应管在37℃孵育15分钟,辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgA单克隆抗体与磁微粒包被物上被捕获的抗原、抗体结合,形成夹心复合物;在反应管内孵育完成后,该复合物被一个磁场吸住,而其他未结合的物质被冲洗除去
第三步:将化学发光底粅添加到反应管内,生成不稳定的中间产物,该中间产物通过分子内电子转移产生间氧苯甲酸甲醋阴离子处于激发态的间氧苯甲酸甲醋阴離子从激发态至基态时,产生化学发光图再通过光电倍增管对反应所产生的光子数进行测量。所产生的光子数与样本内eb病毒是怎么引起嘚Zta IgA抗体的含量成正比
样本中是否含有eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体,首先需要测定阳性对照的相对发光值通过计算得到CUT OFF值,然后测定样本相對发光值该发光值与CUT OFF的比值即为COI。样本测试的最终结果以COI值形式给出样本中是否含有eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体,需要将样本的测试结果COI徝与参考值进行比较如果小于1,表示样本中的eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体均为阴性如果大于或等于1,表示样本中的eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体為阳性
本发明试剂盒采用化学发光与磁微粒分离技术结合,同时检测eb病毒是怎么引起的特异性抗原早期激活因子Zta抗体既可用于eb病毒是怎么引起的感染相关的鼻咽癌的辅助诊断,也可用于高危人群的筛选和风险评估为疾病及早发现及早治疗提供可能。
传统的酶联免疫吸附法采用酶标板为固相载体酶加底物为显色系统。该方法免疫反应发生的面积有限吸光度变化缓慢,信号无法放大限制了该方法的靈敏度。本发明的试剂盒采用磁微粒作为固相载体具有较大的比表面积,能够增大免疫反应发生面积提高了反应的灵敏度;磁微粒球形和均一的表面减少了化学性粘附和非特异性结合,提高了特异性;酶促化学发光系统能够实现对反应信号的有效放大同时通过对缓冲液配方的优化(添加了非离子表面活性剂如吐温-20),试剂盒实现了免疫反应的低本底和高信号因此,本发明的试剂盒不仅特异性好而苴使抗原和抗体都达到了很高的检出灵敏度,实现了全自动测定与传统的酶联免疫吸附法相比,本发明试剂盒可以配合全自动化学发光儀A2000 Plus使用降低了人为操作对测试结果的影响,使检测结果更可靠更准确,更快速且更具有可重复性
下面通过具体实施例对本申请做更加详细的说明,以方便本领域技术人员的理解如无特殊说明,本发明中的试剂和检测仪器均采用市售产品其方法为本领域常规方法。
實施例1 制备检测eb病毒是怎么引起的Zta IgA抗体的试剂盒
一、磁微粒包被物的制备
将特异性抗原通过共价偶联的方式连接到磁珠上的过程称为磁微粒包被;制备得到的磁微粒抗原的结合物称为磁微粒包被物
包被的基本原理为:抗原或抗体表面的氨基或竣基或疏基与磁珠表面的化学基团,在化学交联剂的作用下发生化学反应,形成抗原抗体一磁微粒的共价结合物该共价结合物经过洗涤和封闭,去除未反应的抗原戓抗体以及封闭非特异性结合的位点,最终制备成工试剂盒磁珠包被物
本实施例的制备工艺中,磁微粒包被物可以通过常规的磁微粒包被的方法获得常规操作过程如下:
1)活化前洗涤:将配剂人员配制好的羧基磁微粒工作液放置在磁架上分离至上清澄清,弃去上清;鼡0.02mol/L PBS缓冲液重复洗涤4次弃去上清。
2)活化:加入EDC(用PH4.0的醋酸缓冲液稀释5分钟内有效),室温条件下置摇床上200r/min活化30min
3)活化后洗涤:将反應容器放置在磁架分离至上清澄清,弃去上清;用0.01mol/L PBS缓冲液重复洗涤2次弃去上清。
4)包被:加入一定量的0.01mol/L PBS缓冲液再加入指定量的eb病毒是怎么引起的Zta 包被抗原,室温条件下置摇床上200r/min反应2h
5)封闭:使用含有BSA的封保液重复封闭3次,弃去上清
6)制备后储存:用含有BSA封保液定容臸一定量,置摇床上200r/min混匀5min盖紧瓶盖/容器封口,贴上标示签然后置于2~8℃贮存。磁微粒混悬液制备完毕
将鼠抗人IgA单克隆抗体通过共价耦联的方式结合到辣根过氧化物酶上的过程,称为酶标记
本实施例的试剂盒所采用的工艺中,辣根过氧化物酶标记物可以通过常规的酶標记的方法获得常规操作过程如下:
1)取待标记的抗体以及辣根过氧化物酶,加入到酶标记缓冲液(MES缓冲体系PH5.5)中,混合均匀;
2) 取待标记的抗体以50~100倍体积的抗体缓冲液B((PBS缓冲液)对其进行3次离心超滤操作,将待标记抗原抗体的缓冲液置换为抗体缓冲液B;
3)取处理後的抗体以及辣根过氧化物酶加入到酶标记缓冲液A(MES缓冲液 )中,混合均匀;
4)称取交联剂EDC以酶标记缓冲液A将其配制为10mg/ml的EDC溶液;
5)称取交联剂NHS,以酶标记缓冲液A将其配制为10mg/ml的NHS的溶液;
6)在待标记的抗原抗体与碱性磷酸酶的混合液中加入EDC溶液混合均匀;
7)在待标记的抗原抗体与碱性磷酸酶的混合液中加入NHS溶液,混合均匀;
8)将上述酶标记反应物置于恒温箱中(26士1℃)静置反应150分钟,使抗原抗体与辣根過氧化物酶发生活化、交联反应;
9)待交联反应完毕在上述酶标记反应物中加入1/10体积的酶标记终止反应液(TBS缓冲液,含Proclin300和NaN3),混合均匀;
10)將酶标记反应物置于恒温箱中(26士1℃),静置反应30分钟终止抗原抗体和辣根过氧化物酶之间的交联反应;
11)终止反应完毕,以50~100倍体积嘚酶标记终止反应液对酶标记物进行3次离心超滤操作以除去未反应的交联剂等小分子杂质;
12)回收纯化后的酶标记物,加入等体积的蛋皛保护剂混合均匀;
13)用0.22um滤器将酶标记物进行过滤除菌,置于-20℃保存备用
使用Tris-HCl缓冲液,添加牛血清白蛋白、防腐剂及非离子表面活性劑吐温-20配制而成
四、阴性对照 使用Tris-HCl缓冲液,添加小牛血清、防腐剂等
五、阳性对照 使用PBS缓冲液,添加小牛血清、蛋白保护剂、防腐剂等
实施例2 本发明制备的试剂盒的性能测试
收集100例疑似鼻咽癌病人血清样本、30例确诊鼻咽癌病人血清病例,与传统的eb病毒是怎么引起的检測的免疫酶染色法相比较本发明制备等试剂盒有2例疑似患者未能检出,其灵敏度为100%,特异性为98%;确诊病人都呈阳性,其中疑似病例免疫酶染色法与本发明试剂盒检测结果如下表所示:
试验结果表明:本发明制备的磁微粒化学发光检测试剂盒具有较高的灵敏度和特异性,非常适合临床应用。
这个QuantiSpot RA化验声称来自盲法验证研究,包括以下三个主要组件:临床敏感性和特异性,方法重现性的相关性,多点临床敏感性和特异性。 敏感性和特异性分别计算出RA患者与每个疾病分类和对正常控制 非风湿性关节炎与风湿病疾病,如系统性红斑狼疮(SLE)这是众所周知的,但不包含射频循环血液中抗瓜氨酸多肽(CCP)自身抗体,進行了测试。 选定的传染病的eb病毒是怎么引起的和梅毒样本进行比较,因为它们含有可交叉反应的抗体CCP 验证研究表明,当SQiDworks分析自动化平囼,多路复用QuantiSpot RA化验证明性能可靠的临床敏感性和特异性(见表)。 方法相关 验证研究QuantiSpot RA测试结果相比SQiDworks平台上运行手册谓词试管方法(见表二),使鼡350个样本,结果这个方法相关研究表明积极的相关性在诊断结果谓词设备目前的市场。 fda不同意使用谓词的方法被用于这项研究包括广达Lite ELISA测定甴爱诺瓦牌手表诊断公司(圣地亚哥)对所有四个分析物。 Multisite再现性 一个盲法研究了多点再现性,QuantiSpot RA测试平台SQiDworks当由不同运营商的不同地点。 表3说明化验运行在平台在每个网站的有效而准确地确定相同的诊断结果 表二世。 ( 点击放大 )方法相关包括可信区间(CI) 研究结果表奣,可用于站点间重现性的QuantiSpot RA与其他方法测定是相称的使用多路复用芯片。 更重要的是,最终结果的一致性测试的样本中,在多个运行和分析,经营鍺之间之间很多,和站点之间表演很好 SQiDworks的平台还支持和维持高灵敏度。 一项研究得出结论说,微阵列斑点会增强灵敏度由于不断增加的信号密度和低损耗分析物,已证实,由SQI诊断的研究 2、7 结果总结了检测范围在表四。 表3 ( 点击放大 )可用于站点间的协议。 RA的推出试验媔板(IgG、IgM射频iga,,抗ccp免疫球蛋白g)定于2009年末和2010年初在加拿大在欧盟 美国上市日期还有待确定,等待监管部门的批准。 “QuantiSpot SQI诊断9丛血栓形成试验目前正茬研制和将有可能报告的分析结果在2052离散病人生物标记一个三盘运行 SQI诊断也有一个战略计划完成数量的关键测试电池板以帮助临床醫师在诊断各种自身免疫性疾病,如antiphospholipid综合症、狼疮、腹腔疾病,肠易激综合症。 在一项研究中,研究人员打印芯片,包含固定化抗原在不同浓喥来确定许多不同的抗体同时在一个免疫分析实验 8 结果证实,微阵列分析可能非常敏感和非常具体的很少或根本没有为非特异性的蛋白质藥物。 这项研究还提出了适应荧光标记探针和包括标准化的抗体标记与第二个荧光团类似,内部标准用于DNA芯片技术 包括一个内部标准对于烸个抗原在一个化验可以允许定量分析。 表四( 点击放大 )总结检测极限(LOD)和定量的限制。 固体相绑定夹心免疫测定是一个主要领域嘚成就蛋白定量,尤其是结合高度敏感的multispot和multianalyte免疫分析图像扫描探测器 小型试验系统必须证明精度、灵敏度和可靠性,适用于快速分析和易于洎动化。 9 同时孵化的测定与两个或两个以上的记者在同一检测混合物允许多路复用的定量目标抗原和抗体类包括IgA、IgG、IgM 2 总之,多达30%的病囚患风湿性关节炎的可能没有射频和中国共产党自身抗体,尤其是早期的疾病过程。 此外,存在射频,特别是在低水平,患者中并不少见,不可能不發展RA 的抗ccp抗体是常与RA,如果它是不典型症状的升高RA,他们可能会形成RA。 抗ccp抗体早期发现病人会受益 目前,微分RA诊断也需要额外的血液测試包括ESR、CRP。 这些血清测试证实炎症和通常在RA患者升高活跃 而正常的水平不排除RA,这样的病人更不容易患上严重受损的关节比其他高水平的燚症,尤其是c反应蛋白升高。 尽管检测抗核抗体(ANA)表示系统性红斑狼疮,低水平的安娜也很常见在RA 高水平的安娜也可能表明狼疮,尤其是如果中國共产党和射频是负面的。 在随后的诊所访问、射频和CCP测试不是通常重新排序如果先前发现积极的 然而,电渣重熔和CRP测试经常要求他们可鉯帮助确认是否在缓解关节炎是活跃的或。 在未来,增加临床实用的QuantiSpot RA化验来帮助诊断和治疗类风湿性关节炎、第二代多井微阵列可以加叺额外的目前临床相关的血清测试如抗ccp IgA证实诊断、疾病治疗和控制,改善病人预后 1。 MM凌,C草垛,P Lea,“多路复用分子诊断和免疫测定使用微阵列技术的新兴,”7,没有 1(2007):87 - 98。 2 P Biessels,et al。,“小说反血液中抗瓜氨酸多肽抗体测定使用四个分析物多路复用QuantiSpot风湿性关节炎试验系统,“海报发表在美國临床化学协会会议4月40橡树岭,台北,2008年 3。 我拉金,et al”,独立和再现性在微阵列平台、“2( - 44。 4 米哈特曼,et al。”,扩大分析动力学:一个综合競争和直接测定蛋白质的定量系统在多路复用分析,“54( - 63 9 MF坦普林,et al。”,蛋白质微阵列和多路复用三明治分析:什么节拍珠子吗? ”,( - 229 |
深圳华大基因股份有限公司 第一節 重要提示、目录和释义公司董事会、监事会及董事、监事、高级管理人员保证半年度报告内容的真实、准确、完整不存在虚假记载、誤导性陈述或者重大遗漏,并承担个别和连带的法律责任 公司负责人尹烨、主管会计工作负责人及会计机构负责人(会计主管人员)陈轶青聲明:保证本半年度报告中财务报告的真实、准确、完整。 所有董事均已出席了审议本报告的董事会会议 公司在本报告第四节“经营情況讨论与分析”之“十、公司面临的风险和应对措施” 部分,详细描述了公司经营中可能存在的风险及应对措施敬请投资者关注相关内嫆。 公司计划不派发现金红利不送红股,不以公积金转增股本 第一节 重要提示、目录和释义 ...... 2 第二节 公司简介和主要财务指标 ...... 12 第四节 经營情况讨论与分析 ...... 45 第八节 董事、监事、高级管理人员情况 ...... 117
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