仍然是关于核酸提取(核酸提取,氯仿,分层,异丙醇) - PCR实验 - 生物秀
标题: 仍然是关于核酸提取(核酸提取,氯仿,分层,异丙醇)
摘要: [仍然是关于核酸提取(核酸提取,氯仿,分层,异丙醇)] 小弟做实验郁闷得不行了，10 1国庆还得在实验室过作了几次RNA提取，在加了氯仿和异丙醇后就是不出现3个分层，我也不知道问题出在哪儿，希望牛人指教啊！help me!!!谢谢！ 关键词:[核酸提取 氯仿 异丙醇 分层]……
小弟做实验郁闷得不行了，10.1国庆还得在实验室过作了几次RNA提取，在加了氯仿和异丙醇后就是不出现3个分层，我也不知道问题出在哪儿，希望牛人指教啊！help me!!!谢谢！
回复请看下面的实验步骤！在加入氯仿后会出现分成！请注意实验步骤有没有错误，你用的是不是都好用！（1）细胞用PBS冲洗两遍，根据细胞多少加TRIzol 2－3ml 室温静置5min（2）吹打细胞，每1ml分一个Eppendnrf管（3）每管加0.2mL氯仿，剧烈震荡15S,室温静置2－3min（4）4℃ 12000g 离心15min（5）吸取上清约300ul,加入0.5ml异丙醇，翻转混匀，室温静置10min（6）4℃ 12000g 离心10min（7）弃上清，加75％乙醇1ml(750无水乙醇，250DEPC处理的水)，弹指法混匀。（8）4℃ 7500g离心5min（9）弃上清，干燥5－10min（10）溶于10-20ul DEPC水中（如有多个Eppendorf管，将其余的管冻在－70℃保存），进行下一步的检测。回复请参照yihui88117 的步骤，注意加异丙醇后，室温静置10min回复请参照yihui88117 的步骤，注意加异丙醇后，室温静置10min回复我也是一样，不过我做的是提取，我唯有再离心10分钟，最后可以离心出来了，不过仍在疑惑中，到底这样做正不正确？还望各路高手赐教！回复不明白楼主说的出现三个分层是哪三个分层呢？我提RNA时每次都只有一个分层：加入氯仿时与trizol有分层，离心后倒是有分层，上层为透明水相，中间有一层白色物为蛋白质，其下为有机相（不知楼主指的是否是这个分层?)。取上清，再加异丙醇这时可以出现沉淀物，也没有你说的分层现象。楼上的素蔓看不明白你的问题是什么，所以不知如何解答。是不是说异丙醇沉淀时肉眼没有可视沉淀物，离心之后才有？当然可能了，因为如果你提取血样里的，取样量少，淋巴细胞相对就少，而抽得的DNA量会更少，即使有沉淀也都是些丝状物，如果你的眼神不好的话是不大能看得到的。如果你用5ml血抽提的话，哈哈，感觉就会大不一样了。不过有病人让你这么奢侈的做吗？回复忘了告你，我用小鼠的血约600ul，沉淀时可以见几个象灰尘一样的毛毛儿。
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【求助】抽RNA用的氯仿、异丙醇、乙醇放久了能否继续用，谢谢！
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这个帖子发布于9年零152天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
氯仿、异丙醇、乙醇是师姐以前抽RNA时剩下的，放在室温保存已有1年了。本人抽RNA的时候采用的是Trizol抽提，氯仿、异丙醇、乙醇就用师姐剩下的这些试剂进行抽提。然而，抽提效果很不理想。加入异丙醇离心之后，EP管管底只看到无色的胶状沉淀，根本就看不到所谓的白色沉淀，A260/A280比值在1.3～1.4左右。甚至有的少于1.0。不知道这些试剂放置久了，是否会污染上RNA酶导致RNA降解？希望高手指点一二，不胜感激。
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这些试剂都不贵，还是换了吧，有时候过分节约就是浪费。
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丁香园中级站友
可以考虑这方面的原因,不过我相信不是问题的关键,因为我们实验室的试剂放置超过2年效果仍然很好,但是不排除气温等影响.我想问题的关键还是起始量以及操作的问题,组织或是细胞都加大起始提取的量,在最后沉淀的一步加入3MPH3.8的NAAC可以增加回收效率,最后沉淀放置的时间久一些也可以增加回收效率
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谢谢两位！但似乎用Trizol抽提并没有用到NAAC。步骤大致是这样的：1、加trizol匀浆化2、加氯仿离心之后分成三相3、吸取上层水相到一新的EP中4、加入异丙醇沉淀RNA5、去上清，75％乙醇洗沉淀6、离心，去上清，干燥RNA7、加20～40ulDEPC的水溶解RNA。我抽RNA是要反转录，最后进行PCR的。不知道版主说的是不是把步骤7改为NAAC溶解？另外我对RNA进行了一个琼脂糖电泳【普通的那一种，不是甲醛变性电泳】，可以看到三个明亮的条带，其中18S、28S条带亮度一样。除此之外，在18S、28S之间、5S、18S之间可以看到许多其它条带。不知道说明什么问题？谢谢！
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依医 edited on
用别人剩下的试剂做自己的试验尤其对于新手来说是大忌！
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whitebear 这些试剂都不贵，还是换了吧，有时候过分节约就是浪费。就是这样了
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上述试剂可以用，楼主提取RNA时‘根本就看不到所谓的白色沉淀’除了遵循常规操作外，关键之处要特别注意：一定要用新鲜配置的75％乙醇DEPC水。
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怀念湘水 上述试剂可以用，楼主提取RNA时‘根本就看不到所谓的白色沉淀’除了遵循常规操作外，关键之处要特别注意：一定要用新鲜配置的75％乙醇DEPC水。加入异丙醇之后还没有加75％乙醇前，就没有看到白色的沉淀了。75％乙醇我用的确实是新鲜配制的冰冷的75％乙醇DEPC水。
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关于丁香园大家提取RNA时候用的试剂怎么保护的最近在做RNA提取。买了一些试剂，据说最好自己分装开避免污染。我觉得氯仿、异丙醇之类是否用棕色的瓶子装比较好。实验室有那种玻璃塞子的棕色广口瓶瓶。。这种瓶子能不能200度高温处理。？那应该是不耐热的吧。。。那大家怎么处理的
提RNA的试剂最好是能够单独出来专门用来提RNA。最好不要混着用，反正这些试剂也不怎么贵啊。有的实验室提RNA的所有东西，包括移液器，都是专门的。
也就十几二十块钱的东西，有必要再分装再灭菌么，单独用一瓶就好了么玻璃仪器都能干热灭菌的，170度3h就可以。塑料的用depc处理，溶液都要用depc水配制
德元国际提取RNA，可以找找看
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扫描下载二维码在酚：氯仿：异戊醇中，异丙醇代替异戊醇有没有有同(异戊醇,氯仿,异丙醇) - PCR实验 - 生物秀
标题: 在酚：氯仿：异戊醇中，异丙醇代替异戊醇有没有有同(异戊醇,氯仿,异丙醇)
摘要: [在酚：氯仿：异戊醇中，异丙醇代替异戊醇有没有有同(异戊醇,氯仿,异丙醇)] 在酚：氯仿：异戊醇中，异丙醇代替异戊醇有没有有同？请赐教！ 关键词:[异戊醇 氯仿 异丙醇]……
在酚：氯仿：异戊醇中，异丙醇代替异戊醇有没有有同？请赐教！
回复好像不可以的，在酚：氯仿：异戊醇中异戊醇的作用是去泡剂，避免产生过多的泡沫。异丙醇好像没听说过有这个作用，倒是它可以用来沉淀，70％时洗涤。回复在酚：氯仿：异戊醇中，异戊醇的主要作用是辅助消除氯仿使用蛋白质变性时产生的泡沫，有利于分离。而异丙醇虽也是一种有机溶剂，但其能沉淀DNA，且不利于水和有机相的分离。故在这一比例中（25：24：1）中，不能用异丙醇代替异戊醇。回复谢谢二位的热心解答！我发现有的书上用酚：氯仿：异戊醇而的书上用酚：氯仿：异丙醇，因此我不知道是笔误还是怎么回事。回复呵呵！肯定是笔误了！这样编书真是误人子弟呀！
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电话：021-(请问)哪位高人能指点提取总RNA中各试剂的具体作用?(试剂,氯仿,异丙醇) - PCR实验 - 生物秀
标题: (请问)哪位高人能指点提取总RNA中各试剂的具体作用?(试剂,氯仿,异丙醇)
摘要: [(请问)哪位高人能指点提取总RNA中各试剂的具体作用?(试剂,氯仿,异丙醇)] 我想了解一下TRIZOL试剂提取总RNA的方法中,各试剂:TRIZOL,氯仿 异丙醇及75%乙醇的作用 请各位指教! 关键词:[试剂 氯仿 异丙醇]……
我想了解一下TRIZOL提取总RNA的方法中,各:TRIZOL,氯仿.异丙醇及75%乙醇的作用.请各位指教!
回复在网上用google查询一下其说明书就可以了回复我也是初学RNA提取，据我所知：1.TRIZOL既有裂解液（硫酸氰胍）的成分，又有变性液（酚、氯仿、异丙醇）的成分，硫酸氰胍有破坏细胞结构，使核酸从中解离的作用，并且对RNA酶有强烈的变性作用，是一种最有效的RNA酶抑制剂。酚和氯仿也可以使蛋白质和核酸分离，并且作为蛋白质变性液可以抑制RNA酶活性。2.加入氯仿后分三层，是通过氯仿使蛋白质变性，疏水的氨基酸在有机层，亲水的氨基酸通过离心在中间的白层，核酸亲水在上面的水层。3.加入异丙醇是沉淀RNA，加入75%乙醇是洗涤沉淀，具体我也不清楚，望各位指教！回复三楼的介绍很详细啊，感觉又有新的收获！建议加分回复谢谢anranar的帮忙！回复1.TRIZOL既有裂解液（硫酸氰胍）的成分，又有变性液（酚、氯仿、异丙醇）的成分，硫酸氰胍有破坏细胞结构，使核酸从中解离的作用，并且对RNA酶有强烈的变性作用，是一种最有效的RNA酶抑制剂。酚和氯仿也可以使蛋白质和核酸分离，并且作为蛋白质变性液可以抑制RNA酶活性。2.加入氯仿后分三层，是通过氯仿使蛋白质变性，疏水的在有机层，亲水的通过离心在中间的白层，核酸亲水在上面的水层。
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