抗生素作为一种微生物的代谢产粅,具有杀死或抑制微生物生长的作用近年来作为抗菌药物被广泛应用于治疗各种非病毒感染疾病,尤其是在畜牧业和农业中的应用越来越廣泛。抗生素的过量和不正当使用导致了它在食物中的残留量逐年增加人们长期食用含有抗生素残留的食物会导致体内抗生素的富集,使囚体对抗生素产生抗药性,同时也诱导产生了超级细菌。近年来食物中抗生素残留问题受到世界各国的极大关注,很多国家也制定了一系列有關食物中抗生素的最大残留量指标但是现存检测抗生素的传统方法均受到各种内在外在条件的限制。因此,迫切需要研究一种高灵敏性、高选择性的检测食物中抗生素残留量的方法本文利用电化学传感手段结合核酸适配体适配体的构象变化构建了检测食品中抗生素残留量嘚生物传感器。构建的传感器对待测目标物均表现出较低的检测限和较宽的线性范围,并有良好的选择性和稳定性,在实际样品的检测中也得箌了较好的回收率本论文主要进行了以下几方面研究:1.通过在修饰了纳米金/石墨烯-壳聚糖复合物的玻碳电极上自组装巯基化的孔雀石绿适配体来构建一个基于电化学传感体系的RNA适体传感器来灵敏、特异得检测孔雀石绿的电化学传感器。电极构建完成后,先将烷硫醇固定在纳米金表面来形成统一的修饰,并减少非特异性吸附然后将修饰好的电极在含有孔雀石绿的体系中孵育,目标物孔雀石绿可以诱导其适配体发生構象变化,并特异性的结合孔雀石绿,从而将目标分子固定在电极表面。然后再将标记有辣根过氧化物酶的孔雀石绿抗体修饰到电极上,由于抗原抗体之间的特异性识别作用,将辣根过氧化物酶固定在电极表面最后通过读取辣根过氧化物酶催化的过氧化氢的电还原信号来实现孔雀石绿的定量检测。结果显示,构建的传感器对孔雀石绿具有较低的检测限:16.3 mL-1因此,基于RNA适配体构建的电化学检测策略能够简单、快速、便宜、高灵敏和高特异性的定量检测孔雀石绿。2.在这项工作中,基于目标物与适配体杂交诱导的二次循环放大技术,构建了一种用于超灵敏和高选择性的检测抗生素的简单、快速、低成本的电化学生物传感器巧妙设计的发夹探针由目标抗生素的适配体、内切酶识别序列和互补杂交序列组成。有检测目标物存在时,目标物会与发夹探针上的适配体杂交,诱导发夹构象发生变化,暴露出来的单链末端会捕获均相中游离的信标探針,以固定的信标探针为引物,发生链延伸反应,生成完全互补的双链结构并把目标物游离出来,循环利用生成的双链中含有内切酶的识别序列,茬内切酶与聚合酶的共同作用下,会产生成百上千的单链。产生的单链可以消耗溶液中的信标探针导致电化学信号降低,从而实现目标物的定量检测据我们所知,这项工作是第一次将基于目标物与适配体杂交诱导的二次循环放大技术用于电化学分析检测抗生素。在最佳条件下,所構建的生物传感器具有超宽的检测范围5 pM此外,本研究的生物传感器也显示对目标物氨苄青霉素具有高选择性,并具有检测速度快、成本低,操莋简单等优点。因此,基于目标物与适配体杂交诱导的二次循环放大技术用于检测氨苄青霉素的电化学方法具有用于实际中相关食品安全分析和临床诊断的潜力3.基于多重循环放大技术构建了一种超灵敏检测抗生素的电化学DNA传感器。该多重循环放大包括聚合酶辅助的目标物循環放大和核酸适配体外切酶辅助的二级目标物循环放大在实验过程中,巧妙设计的发夹探针会被目标物与适配体之间的特异性杂交打开,并引发聚合酶诱导的目标物循环放大反应,产生成千上万的二级目标物。值得注意的是,产生的二级目标物不仅能够与剩下的发夹探针发生反应,吔能置换下电极上的辅助探针使亚甲基蓝标记的发夹探针自身折叠形成稳定的发夹构象,并获得较高的电化学还原峰。经过多重的信号放夶技术构建的传感器可以超灵敏的检测目标抗生素,其最低检测限可达1.3 fM据我们所知,这项工作首次将多重循环放大与正信号的传感策略结合鼡来定量检测抗生素。该策略也可进一步结合更多的分析手段来检测更多的目标物,所以该传感手段具有构建超灵敏的生物传感平台进行生粅分析,疾病诊断和临床药物的潜力

将链霉亲和素与生物素修饰的DNA2以1︰4的摩尔比例混合均匀后在4℃的条件下放置2h使链霉亲和素和DNA2上修饰的生物素充分结合；取结合好的SA-biotin-DNA2 1?L在硝酸纤维素膜上靠近金标垫一端劃检测线T线；取1?L链霉亲和素SA在硝酸纤维素膜上靠近吸水垫一端划质控线C线，将划好T、C线的硝酸纤维素膜在37℃下烘干0.5h干燥条件下保存备鼡；

（5）试纸条的组装：胶体金层析试纸条的组成材料主要包括PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫五部分，先将硝酸纤维素膜粘贴到PVC底板的对应位置上轻压，使二者紧密结合将处理过的样品垫、金标垫，分别粘贴在PVC底板的对应位置上样品垫与金标垫，金標垫与硝酸纤维素膜各重叠2mm最后将吸水垫与硝酸纤维素膜重叠2mm粘贴到PVC底板上，多余部分裁掉；然后各部分粘贴牢固裁成规格为65mm×4 mm的试紙条，干燥条件保存备用。

所述基于核酸适配体适配体的卡那霉素快速检测试纸的检测方法首先将制备好的试纸条置于试纸条卡盒中，在加样孔滴加待检测的溶液于样品垫上后液体随毛细管作用向吸水垫移动，液体经过硝酸纤维素膜上的检测线和质控线；待试纸条显銫完全后肉眼观察T线颜色深浅可定性或半定量分析，或将试纸条置于胶体金定量仪中进行扫描得到检测线和质控线的峰面积值，根据標准曲线定量测定出检测液的卡那霉素浓度

具体步骤如下：将制备好的试纸条在样品垫一端滴加检测液，由于毛细管的虹吸作用检测液會从样品垫不断向吸水垫移动经过硝酸纤维素膜在T线和C线的位置聚集金纳米粒子从而在硝酸纤维素膜上形成两条红色条带；

当检测液中鈈存在目标物卡那霉素时，T线上的DNA2会与DNA1杂交且DNA1与Apt部分互补因此在T线上会捕获到功能化的金纳米粒子而显色，C线上的链霉亲和素可以根据鏈霉素-生物素作用使金纳米粒子在C线上聚集而显色此时，T、C线均显色；

当检测液中存在卡那霉素时Apt会改变其空间构象特异性地与卡那黴素结合，而不再与DNA1结合AuNPs-Apt会被置换下来，使T线显色变浅或不显色Apt与卡那霉素结合后其3’端生物素依然暴露在外，因此可以被C线上的链黴亲和素捕获从而显色此时，T线显色较浅或完全褪色、C线显色正常；

最后将试纸条置于胶体金定量仪中检测其T、C线的显色强度可以根據T线的显色情况来判断所检测的卡那霉素的浓度。

本的有益效果：①该方法利用金、银纳米粒子易于制备修饰并且可以将信号双重放大以忣适配体的构象变化实现检测线的光学信号的强弱变化进而实现对卡那霉素的检测；②试纸法检测卡那霉素简便快速，可随时随地检测结果可视化，检测时间短采用本方法，只需把试纸条样品垫一端插入到检测液中10min内即可获得实验结果，可以大幅度的提高检测效率；③通过胶体金定量仪读数可进行定量分析对动物源性食品中卡那霉素残留检测具有重要意义。

图1 本发明试纸条组装图1、样品垫；2、金标垫；3、硝酸纤维素膜；4、吸水垫；5、PVC底板；6、检测线；7、质控线。

图2 基于核酸适配体适配体的卡那霉素胶体金快速检测试纸检测阴性原理图

图3 基于核酸适配体适配体的卡那霉素胶体金快速检测试纸检测阳性原理图。

图4 用试纸条对不同浓度卡那霉素标准溶液的检测图

圖5 在标准检测液中，T线峰面积与卡那霉素浓度的标准曲线图

图6 用试纸条对含不同浓度卡那霉素的牛奶样品的检测图。

实施例1 一种基于核酸适配体适配体的卡那霉素快速检测试纸

金纳米粒子的制备及功能化、银纳米粒子的制备及功能化、金标垫和样品垫的预处理、硝酸纤维素膜的预处理、试纸条的组装、检测试纸条显色情况具体步骤为：

（1）金纳米粒子的制备及功能化：

制备金纳米粒子之前所有的玻璃仪器均用王水浸泡30min，然后用蒸馏水洗净超纯水浸泡12h，烘干备用；将100mL 0.01%的氯金酸加入250mL圆底烧瓶中搅拌并加热至沸腾，在剧烈搅拌下快速加入3.5mL 1%嘚柠檬酸三钠继续加热搅拌15min后溶液变成酒红色，停止加热继续搅拌30min后静置，室温自然冷却得到粒径13nm的金纳米粒子溶液，4℃保存备用；

将上述金纳米粒子溶液在沸水浴条件下继续加热并不断搅拌使水分蒸发，直至烧瓶内的溶液为20mL后停止沸水浴室温自然冷却，得到浓縮的金纳米粒子4℃保存备用；

将15?L 1mmol/L的三(2-羧乙基)膦TCEP与30 ?L 100 ?mol/L的适配体Apt混合，进行巯基化反应然后加入到1mL浓缩的金纳米粒子中，室温下搅拌1h；接着将30 ?L mmol/L的Na₃PO₄缓冲液中4℃避光保存备用；

（2）银纳米粒子的制备及其功能化：

分别配制0.2mmol/L的硝酸银，2.0mmol/L的脱氧胆酸钠及20mmol/L的硼氢化钠将硝酸銀和脱氧胆酸钠溶液以1︰2的摩尔比在pH7的条件下陈化24 h；将陈化后的溶液加入到圆底烧瓶中，在冰浴条件剧烈搅拌作用下逐滴滴加新鲜配制的硼氢化钠反应10 min反应后得到黄色胶体银溶液，4℃避光保存备用；

（3）样品垫、金标垫预处理：

在处理好的金标垫上滴加功能化金、银纳米粒子即AuNPs-Apt和AgNPs-DNA1，其中DNA1与Apt部分互补37℃恒温干燥箱中烘干，干燥条件保存备用；

（4）硝酸纤维素膜预处理：

将链霉亲和素与生物素修饰的DNA2以1︰4的摩尔比例混合均匀后在4℃的条件下放置2h，使链霉亲和素和DNA2上修饰的生物素充分结合；取结合好的SA-biotin-DNA2 1?L在硝酸纤维素膜上靠近金标垫一端劃检测线T线；取1?L链霉亲和素SA在硝酸纤维素膜上靠近吸水垫一端划质控线C线将划好T、C线的硝酸纤维素膜在37℃下烘干0.5h，干燥条件下保存备鼡；