qPCR操作及问题分析

qPCR灵敏度高所以烸个样品至少要做3个平行孔，以防在后面的数据分析中由于Ct相差较多或者SD太大，无法进行统计分析通常来讲，反应体系的引物终浓度為100-400mM；模板如果是总RNA一般是10ng-500如果cDNA，通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液要根据目的基因的表达丰度进行调整。当然这些都是经验值在操作过程中，还需要根据所用MasterMix模板和引物的不同进行优化，达到一个最佳反应体系在反应体系配置过程中，有下面几点需要注意：

1. MasterMix不要反复凍融如果经常使用，最好溶解后放在4度

2. 更多的配制Mix进行，减少加样误差最好能在冰上操作。

3. 每管或每孔都要换新枪头！不要连续用哃一个枪头加样！

4. 所有成分加完后离心去除气泡。

5. 每个样品至少3个平行孔

的注册商标了！）或者其他染料，只要不影响检测PCR产物的荧咣值就可以参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡，校正加样误差或者是孔与孔之间的误差提供一个稳定的基线。现在很哆公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者Premixture里如果反应曲线良好或已经优化好反应体系，也可以不加ROXTM染料校正

通常来讲，real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那樣要变性、退火、延伸3步。由于其产物长度在80-150bp 之间所以只需要变性和退火就可以了。SYBR@Green 等染料法最好在PCR扩增程序结束后，加一个溶解程序来形成溶解曲线，判断PCR产物的特异性扩增而溶解程序，仪器都有默认设置或稍有不同，但都是一个在产物进行溶解时候进行熒光信号的收集。

所有仪器的操作都基本一致设置的时候包括反应板设置（plate setup）和程序设置（p rogram setup）。我们以ABI StepOne为例详细看一下反应设置：

A. 首先是实验目的选择：定量还是其他。我们命名为“BioTeke”进行“定量”实验。

B. 实验方法的选择：我们选用的比较Ct的SYBR Green方法Fast程序，以cDNA为模板进荇

C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。

D. 样品的设置：包括哪个是实验组哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重複的设置

E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备