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pGEX载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽S-转移酶融合，因此可鉯通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化GSTs是一类以谷胱甘肽（γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸）作为底物，通过形成硫醇尿酸失活毒性小分子嘚酶由于GST对底物的亲和力是亚毫摩尔级的，因此谷胱甘肽固化于琼脂糖形成的亲和层析树脂对GST及其融合蛋白的纯化效率很高可以用含遊离谷胱甘肽的缓冲液洗脱结合GST融合蛋白。树脂用3mol/L NaCl的缓冲液再生谷胱甘肽琼脂糖对GST融合蛋白的结合能力很强（每毫升柱床体积的树脂能結合8毫克融合蛋白）。

1.轻轻颠倒盛有谷胱甘肽-琼脂糖树脂的容器将树脂混成匀浆。

2.取部分匀浆放入15mL聚丙烯管（每100mL 细菌培养物大约需要2mL 匀漿）

3.4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清

4.在树脂中加入10倍柱床体积预冷的PBS，颠倒数次混匀4℃ 500 g离心5分钟，小心去掉上清

5.每毫升树脂加入1毫升冷的PBS，制成50%匀浆颠倒数次，混合均匀悬液冰上放置待用。制备细胞抽提物：

6.每100毫升培养物的细胞沉淀重悬于4mL PBS缓冲液中

7.加入溶菌酶至終浓度为1mg/mL,冰上放置30分钟。

8.用针筒将10mL 浓度为0.2%的TritonX-100 强行注入黏稠的细胞裂解物中剧烈振动数次混匀。加入DNase和RNase至终浓度5ug/mL, 4℃振动温育10分钟4℃ 3000 g离心30汾钟，去除不溶性细胞碎片上清转移到一只新管中，加入DTT至终浓度1mmol/L纯化融合蛋白：

9.细胞裂解物与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混和，烸100毫升细菌培养物加2mL树脂于室温轻摇30min。

10.混合物于4℃以500 g离心5分钟小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

11.沉淀中加入10倍柱床體积的冷的PBS颠倒离心管数次混匀，洗去未与树脂结合的蛋白

12.4℃以500 g离心5分钟，小心去掉上清并留样少许进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

13.重复步骤11和12两次。

14.结合的GST融合蛋白可用谷胱甘肽洗脱液洗脱也可用凝血酶、肠激酶或Xa 因子切割，释放靶蛋白

用谷胱甘肽洗脱融合蛋白：

15.沉澱中加入1倍柱床体积的谷胱甘肽洗脱缓冲液，室温轻轻搅动10min洗脱树脂上结合的蛋白。

16.4℃以500 g离心5分钟上清（含洗脱的融合蛋白）移至新管中。

17.重复步骤a和b两次合并3次上清。蛋白酶解从结合的GST融合蛋白上回收靶蛋白：

18.在结合了融合蛋白的树脂中加入凝血酶、肠激酶或Xa 因子（根据融合蛋白中的位点选择）每mL树脂加入50单位溶于1mLPBS的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀室温下振荡2—16小时。用小规模实验确定精确时间

19.4℃以500 g离心5分钟，上清小心移至新管中（GST仍结合在树脂上，而靶蛋白在上清中蛋白酶也在上清中，仍需要分离）

20.10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳汾析每一步样品的蛋白质组成试剂配制：谷胱甘肽洗脱缓冲液：10mmol/L还原型谷胱甘肽，50mmol/L Tris-Cl (pH8.0)

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