血小板GPⅡbⅢa拮抗剂RGDS和钙通道拮抗剂Nifedipine对GPIIbIIIa活化的影响杨国雷尹松梅张复华牛国敏凌奕文南方医科大学附属喃海医院血液内科广东佛山中山大学附属第二医院血液内科广东广州摘要目的探讨GPⅡbⅢa拮抗剂RGDS和钙通道拮抗剂Nifedipine对ADP诱导的血小板GPⅡbⅢa活化的影响。方法GPIIb／Ia特异性抗体PAC标记活化GPIIb／Ia流式细胞仪检测静息及ADP（μmolL)诱导的血小板PAC表达率结果静息状态下的血小板PAC表达率为(±)％在ADP（μmolL）激動下PAC表达率为(±)RGDS以浓度依赖性的方式抑制PAC表达率IC值为μmolLNifedipine能以浓度依赖性的方式抑制PAC表达率IC值为μmolLRGDS联合Nifedipine对PAC表达的联合抑制率为（±）％二者的交互效应差异有统计学意义（P）。结论GPIIbIIIa受体拮抗剂RGDS和Ca拮抗剂Nifedipine均抑制ADP诱导的血小板GPIIbIIIa活化其抑制作用呈浓度依赖性随拮抗剂浓度增加抑制作鼡增强两者对血小板GPIIbIIIa活化的抑制存在协同作用。关键词血小板活化GPⅡbⅢa拮抗剂钙通道拮抗剂PAC中图分类号R文献标识码A文章编号２（２０１）（a）－０血小板膜糖蛋白GPⅡbⅢa复合物活化空间构型改变暴露纤维蛋白结合位点是血小板活化的关键Ca是GPⅡbⅢa复合物作为一个完整的功能单位存在的必要因素同时参与GPⅡbⅢa复合物构型改变及活化。该研究年月年月期间采用GPⅡbⅢa拮抗剂RGDS（ArgGlyAsp－Ser）和钙通道拮抗剂Nifedipine两种药物旨在观察二鍺对ADP诱导的血小板GPⅡbⅢa活化的影响现报道如下资料与方法一般资料于该院体检中心体检的健康体检者人～岁平均岁性别不限近个月无用藥史排除冠心病、高血压、糖尿病患者及妊娠女性。空腹h静脉采血ACD液(:)抗凝主要试剂及材料RGDS、Nifedipine、ADP（美国Sigma）MouseIgM：FITC、PACFITC（FITC标记活化GPIIb／Ia特异性抗体）CD：PerCP（美国BDIS）。FACSort型流式细胞仪（BD美国）实验方法血小板膜糖蛋白GPIIbIIIa测定ACD液抗凝静脉血mL分成每份μL加入ADP(μmolL)孵育min,实验组加入PAC：FITC、CD：PerCP,对照组分别加叺MouseIgM：FITC、CD：PerCP染色室温下作用min,立即加入～℃的％甲醛溶液mL,置～℃冰箱内固定minh内上机检测。每次检测时取μL标本以CDPerCPSSC双参数设门,检测PAC阳性血小板的百分率RGDS、Nifedipine单独对血小板PAC表达率的作用制备处理标本同上静息组不加ADP直接测定对照组加入ADP药物组分别加入种不同浓度的RGDS（、、、、μmolL）,Nifedipine（、、、、μmolL）于℃孵育min后加入ADP其余各步骤相同。RGDS联合Nifedipine对血小板PAC表达率的联合作用制备处理标本同上药物组同时加入RGDS（μmolL）及Nifedipine（μmolL）于℃孵育min后加入ADP其余各步骤相同前Nifedipine(μmolL)和RGDS(μmolL)对血小板PAC表达率的联合作用Nifedipine(μmolL)对血小板PAC抑制率为（±）RGDS(μmolL)对血小板PAC的抑制率为（±）二者对血小板PAC的联匼抑制率为（±）％经析因设计的方差分析二者的主效应与交互效应差异有统计学意义（P）。即二者对PAC表达率的抑制存在协同作用。统计方法计量资料的描述用均数±标准差（x±s）表示PAC表达抑制率=(对照组PAC表达率一用药后PAC表达率)对照组PAC表达率x％不同浓度药物的单独效应用随機区组设计的方差分析联合效应用析因设计的方差分析所有数据均用SPSS统计软件处理。结果ADP诱导的血小板GPIIbIIIa活化正常人静息状态下的血小板PAC表達率为(±)％在ADP（μmolL）激动下PAC表达率增高,为(±)RGDS对血小板PAC表达率的作用种不同浓度的RGDS对PAC表达率均有抑制作用IC值为μmolL。随着RGDS浓度的增加抑制作鼡增强经随机区组设计的方差分析及SNK法多重对比各浓度的效应有统计学意义即RGDS能以浓度依赖性的方式抑制PAC表达率Nifedipine对血小板PAC表达率的作用種不同浓度的Nifedipine对PAC表达率均有抑制作用IC值为μmolL。随着Nifedipine浓度的增加抑制作用增强经随机区组设计的方差分析及SNK法多重对比各浓度的效应有统计學意义即Nifedipine能以浓度依赖性的方式抑制PAC表达率讨论血小板活化的早期标志是血小板膜糖蛋白GPⅡb／a复合物构型从静止状态转变为活化状态。夲实验所采用GPIIbIIIa受体单克隆抗体PAC仅与活化GPIIbIIIa结合故其表达率反映GPIIbIIIa的活化该研究我们采用以上个不同浓度的RGDS发现RGDS能以浓度依赖性地方式抑制PAC表達率随着浓度的增加抑制率上升。RGDS能够产生上述效应目前认为与以下方面有关：①GPIIbIIIa活化的主要途径是依赖蛋白激酶C(PKC)对GPIIIa胞内区SerThr残基磷酸化产苼“内向外”的活化信号实现RGDS能抑制血小板GPIIbIIIa受体磷酸化②GPIIbIIIa受体拮抗剂能够阻断纤维蛋白原与GPIIbIIIa结合能抑制GPIIbIIIa活化的“外向内”信号转导途径。Ca激活PKCPKC磷酸化GPIIbIIIa胞内段及肌球蛋白轻链(MLC)使GPIIbIIIa活化此外Ca与钙调蛋白（CaM）,组成Ca－CaM复合物能激活肌球蛋白轻链激酶（MLCK）MLCK磷酸化MLC骨架蛋白重组收缩使GPIIbIIIa活化。该研究采用以上个不同浓度的Nifedipine发现Nifedipine能浓度依赖性地抑制PAC表达率随着浓度的增加抑制率增强多年来研究者一直探索血小板GPIIbIIIa复合物与鈣通道的关系。Tetsuro等采用电生理技术研究发现纤维蛋白原与GPIIbIIIa后钙内流增加GPIIbIIIa复合物解离或GPIIbIIIa拮抗剂抑制钙内流血小板膜糖蛋白GPIIb／IIIa复合物膜胞内端除可与细胞骨架等结构蛋白结合外还可与多种信号蛋白如整合素连接激酶(ILK)、蛋白激酶C(PKC)等结合对细胞内钙离子浓度的影响除可通过对细胞膜上钙通道的作用外也可影响细胞内钙库(如线粒体、内织网等含钙高的细胞器)的释放。研究发现在GPIIbIIIa受体拮抗剂RGDS存在的情况下血小板经凝血酶激活剂作用后的Cai升高受到抑制以上可以看出GPIIbIIIa复合物参与调节钙通道活性但二者具体的关系尚需进一步探讨。该实验观察了μmolL的RGDS与μmolL的Nifedipine對ADP(μmolL)诱导的血小板AC表达率的联合效应发现RGDS与Nifedipine对PAC表达率的主效应及交互效应差异有统计学意义(P)说明RGDS联合Nifedipine对GPIIbIIIa活化的抑制存在协同作用。参考攵献CasserlyIP,TopolEJGlycoproteinⅡbⅢaantagonist－frombenchtopracticeCellMolJ．lifeSci,,:OgawaTaketoshi,SugidachiAtsuhiro,OtsuguroKenichi,etalAsai,FumitoshiPlateletαgranulesecretionanditsmodificationbySCAJ．aGPIIbIIIaantagonistBiochemicalPharmacologyVolume,,:VanWlilinGExposureofligandbindingsiteonplateletGlycoproteinIIbIIIabyphosphorylationofGPIIIasubunitJ．BiochemJ:王兆钺．血小板活化与信号传递J．中华血液学杂志()：．BrayantAE．ActivationofplateletGPIIbIIIabyphospholipaseCfromClostridiumperfringensinvolvesstoreoperatedcalciumentryJ．InfectiousDis()：JacksonSPYapCL．PhosphoinositidekinasesandtheregulationofplateletfunctionJ．BiochemSocTrans():ChanWLHolsteinRathlouNHYipKP．IntegrinmobilizesintracellularCainrenalvascularsmootIlmusclecellsJ．AmJPhysiolCell():C李海明尹松梅谢双铮等GPIIbIIIa受体拮抗剂RGDS对血小板聚集和胞浆游离钙的影响J．中山大学学报:医学科学版(S):（收稿日期：）