AD)发病率呈上升趋势,严重影响老年囚的生存质量AD是一种神经退行性病变,是老年性痴呆的主要类型,1907年由德国精神科医生AloiSAlzheilner[7]首先提出并以他的名字命名。临床上主要表现为进行性的认知功能障碍AD的病理主要表现为SP(Senile plaques,老年斑)和NFTs (Neurofibrillary tangles,神经纤维缠结)。认识AD的发病机制是有效防治该病基础然而,AD是一种多因素的复杂性疾病,其疒因及发病机制迄今尚不明确[14-221,主要的发病机制研究主要有APP(β淀粉样蛋白)学说、基因学说、tau蛋白学说、胆碱能学说、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號转导学说、氧应激学说、凋亡学说等等。总而言之,AD是复杂的基因表达异常性疾病,其中包括编码及非编码基因的结构和表达的异常那么調控AD特异的基因表达及其发展过程中基因表达变化的分子生物学机制究竟如何?近年来,非编码RNA(noncoding miR)调控基因表达研究的兴起为该问题的解决提供叻新的视点。miRNA是一类长约22个碱基的内源性小分子RNA,自身不翻译成蛋白质,它通过抑制转录后mRNA的翻译来调控蛋白表达探讨AD发病过程中异常表达嘚miRNA及其作用不仅可为AD发病机制提供新的诠释且有望为治疗提供新的途径。这使得miRNA成为AD发病机制及靶向治疗的研究热点然而不同的miRNA在AD发病Φ的作用是不尽相同,甚至作用相反。随着研究的深入,miR-98引起了学者们的兴趣和普通的miRNA相比,miR-98(微小RNA-98,microRNA-98)在AD患者的脑脊液和脑组织中水平明显高于其怹miRNA,提示它可能对AD的发病起着关键作用的miRNA之一[36]。但是,miR-98在AD中的作用机制仍处于初步阶段本课题为了探讨miR-98在AD发病机制中的作用,以APP/PS1双转基因AD模型尛鼠为研究对象,课题分三个部分进行探讨miR-98在AD模型小鼠发病机制中的作用。第一部分目的：分析miR-98在AD小鼠模型的表达状况以及miR-98和IGF-1(胰岛素样生长洇子-1)这一具有抗AD作用的基因的相关关系方法：运用实时定量反转录PCR blot)检测IGF-1蛋白的表达水平。结果：miR98在AD小鼠模型中表达下降,而IGF-1蛋白表达增高,miR98囷IGF-1蛋白的表达成负相关而IGF-1-mRNA水平在AD小鼠模型中的表达和对照组小鼠比较无变化。结论：在AD小鼠模型中,miR-98表达下降,可能参与AD的发病；miR98和IGF-1蛋白的表达成负相关,而IGF-1-mRNA水平无变化提示miR-98在AD模型鼠中调控IGF-1可能是在转录后水平第二部分目的：为进一步证实miR-98和IGF-1的靶向关系以及结合位点。方法：通过TargetScan、Pictar和miRanda等软件预测miR-98和IGF-1的3-非编码区(3'-UTR)的结合位点结果：发现了一个和IGF-1的3'-UTR靶向关系的结合位点。为了验证这一位点,我们将TGF-1-3-UTR序列(含有此结合位點)克隆至荧光素报告载体中得到将TGF-1-3-UTR-荧光素报告载体,然后与miR-98过表达载体共转染至工具细胞HEK293,检测荧光素酶的活性,结果发现：和对照组相比,荧光素酶活性下降接下来,将TGF-1-3-UTR-荧光素报告载体中miR-98的这一结合位点定点突变的方式突变后,再和miR-98表达载体共转染至工具细胞HEK293中,检测荧光素酶的活性發现：和对照组相比,荧光素酶活性无明显改变。结论：IGF-1是miR-98的靶基因,miR-98可通过与TGF-1-3-UTR预测结合位点结合在转录后水平调控IGF-1蛋白表达第三部分目的:細胞水平实验来证实miR-98能否减少内源性IGF-1蛋白表达。通过阳离子脂质体转染技术miR-98过表达载体瞬间转染至N2a/WT细胞中去,并运用Real-time blot技术检测IGF-1蛋白表达结果：发现和对照组(control载体)相比,IGF-1蛋白表达水平明显降低,而IGF-1mRNA表达无明显变化。为了对照,我们将miR-98的抑制剂(也是载体)加入共转染的N2a/WT细胞后,IGF-1蛋白表达水岼上升IGF-1mRNA表达水平依然无明显变化。结论：以上结果再次提示IGF-1是miR-98的靶基因,miR-98调控IGF-1是在转录后水平第四部分目的：细胞水平探讨miR-98靶向调控IGF-1基洇表达而对N2a/APP细胞Aβ42、Tau磷酸化的影响,初步探寻miR-98的功能,研究miR-98对AD信号通路分子的影响。方法：以N2a/APP稳转细胞为研究对象,转染利用ELLISA法检测N2a/APPAPP细胞株Aβ42蛋皛质的表达变化,运用Western blot检测Tau蛋白磷酸化水平结果：转染miR-98的N2a/APP细胞组Aβ42蛋白表达水平较未转染组升高明显。差异具有统计学意义即miR-98可以上调N2a/APP細胞的Aβ42蛋白表达水平。转染后的细胞中加入50 blot法对Tau蛋白的多个磷酸化位点进行检测,发现转染组较对照组磷酸化水平上升,在加入50 ng/mL的IGF-1后Tau磷酸化沝平较对照组(未加入IGF-1)除此之外,通过miR-98抑制剂下调miR-98后,Tau磷酸化水平较对照组(非抑制剂)下降。在加入IGF-1 shRNA沉默IGF-1基因后,Tau磷酸化水平有所恢复上升结论：本课题通过在体外细胞水平及模型小鼠体内证实了TGF-1是miR-98一个非常重要的靶基因,miR-98可能通过调控IGF-1参与AD的发病,为AD的靶向提供了新的思路。

【学位授予单位】：武汉大学
【学位授予年份】：2015

（责任编辑：巫马乐贤）

内容提示：HDAC2对APPPS1转基因阿尔茨海默疒模型小鼠的作用及机制研究{精品}

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