绵羊Myostatin基因shRNA干扰载体及双元干扰载体的构建与鉴定--《中国畜牧兽医学会养羊学分会2014年全国养羊生产与学术研讨会议论文集》2014年
绵羊Myostatin基因shRNA干扰载体及双元干扰载体的构建与鉴定
【摘要】：为利用RNAi技术研究绵羊肌肉抑制素基因(myostatin,MSTN)的作用,设计针对MSTN编码序列的shRNA干扰片段,合成shRNA干扰序列M1、M2,各自制备成双链寡核苷酸,退火后形成的寡核苷酸双链克隆到Pgenesil载体。连接产物转化到感受态细胞,增菌,质粒扩增,质粒DNA抽提,使用PstⅠ、kpnⅠ进行双酶切和DNA测序鉴定重组克隆。为了比较双元干扰载体与单元干扰载体的干扰效率,将干扰序列M1、M2连接到同一载体,进行一个载体编码两条shRNA的双元干扰片段载体的构建。经酶切及测序鉴定两种载体均构建成功。
【作者单位】：
【分类号】：Q78;S826
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400-819-9993连接转化一般多少ng的DNA最合适?(连接酶,插入片段,载体,大肠杆菌) - DNA技术 - 生物秀
标题: 连接转化一般多少ng的DNA最合适?(连接酶,插入片段,载体,大肠杆菌)
摘要: [连接转化一般多少ng的DNA最合适?(连接酶,插入片段,载体,大肠杆菌)] 一般连接推荐10微升体系,200ng左右的连接量(如promega),但有些连接比较难,所以都用海量载体和插入片段,加大连接酶的用量 然后将连接产物全部加入体系中 但我们一般用50微升~200微升的转化量,108次方转化效率的大肠杆菌(Escherichia coli)。在这样的条件下,DNA加入量过大是否会有毒性,是否会对转化造成影响？ 关键词:[载体 插入片段 大肠杆菌 连接酶 转化效率 连接产物]……
一般连接推荐10微升体系,200ng左右的连接量(如promega),但有些连接比较难,所以都用海量载体和插入片段,加大连接酶的用量.然后将连接产物全部加入体系中.但我们一般用50微升~200微升的转化量,108次方转化效率的大肠杆菌(Escherichia coli)。在这样的条件下,DNA加入量过大是否会有毒性,是否会对转化造成影响？
回复insert DNA(ng)=nmol数*660*片段长度比如说1ul载体(0.03pmol),所需的片段的mol数应该是0.06-0.3pmol之间(1:2-10的比例),那么insert DNA(ng)=(0.06~0.3)*660*片段长度以上指pmd18,其他的我就不知道了
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[中学联盟]江苏省包场高级中学人教版高中生物高考复习同步测试：基因表达载体的构建
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基因表达载体的构建（高三生物）
1、如图为某种质粒的简图，小箭头所指分别为限制性核酸内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，P为转录的启动部位。已知目的基因的两端有EcoRⅠ、BamHⅠ的酶切位点，受体细胞为无任何抗药性的原核细胞。下列有关叙述正确的是( )
A．将含有目的基因的DNA与质粒分别用EcoRⅠ酶切，在DNA连接酶作用下，生成由两个DNA片段之间连接形成的产物有两种
B．DNA连接酶的作用是将酶切后得到的黏性末端连接起来，形成一个重组质粒时形成两个磷酸二酯键
C．为了防止目的基因反向粘连和质粒自行环化，酶切时可选用的酶是EcoRⅠ和BamHⅠ
D．能在含青霉素的培养基中生长的受体细胞表明该目的基因已成功导入该细胞[来源:学科网ZXXK]
2、若要利用某目的基因（见图甲）和P1噬菌体载体（见图乙）构建重组DNA（见图丙），限制性核酸内切酶的酶切位点分别是Bgl Ⅱ（A↓GATCT）、
EcoR Ⅰ（G↓AATTC）和Sau3A Ⅰ（↓GATC）。下列分析合理的是（ ）
A．用EcoR Ⅰ切割目的基因和P1噬 [来自e网通客户端]
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【求助】连接产物转化的问题
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这个帖子发布于12年零161天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
各位大侠:我最近做了两次连接,电转化后,铺平板竟然不长,感受态没有问题,电转化也是按照说明做的,应该没有问题,我想就算连接不上也应该有细菌在平板上长出吧,请大家帮忙分析一下:我的两片段是：一是salI的两末端，另一载体是两个xhol末端，按理两者是同尾酶，连接是可以的，但是我发现连接却不是想象中的简单，我的体系是10ul,16度过夜，载体与插入片段是1比4，酶是takara 的T4酶，请教有没有人作过类似的连接呢？请高手指点迷津，谢谢！在线等！！
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同尾酶酶切后，因为产生同样的末端，应该去磷酸化。
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我最近做了比较多的连接与电转，由于是用于构建cDNA文库，所以要求连接和转化效率高，因此积累了一点点经验。你的问题总体看来应该从连接和转化两方面来考虑和寻找原因：首先，你似乎仍没有搞清楚究竟是连接的问题还是转化的问题。要搞清是否是转化的问题其实非常简单，你只要下次转化时用质粒平行做个阳性对照就行了，其实这是做转化和其他实验的一个基本常识（”不设对照不做实验“，专家语）。质粒的浓度1ng/ul取1ul转化即可，这样的浓度一般只要涂1ml转化菌液中的10ul即可长满平板，如果用质粒转化没有克隆，就是转化的问题了。当然，实验中还应该设置一个加1ul水作为转化物的阴性对照，以判断菌株有没有问题。对于电转化，决定成败的关键我感觉主要是以下三点：1 洁净。这包括从摇菌到洗菌一般都要求用超纯水（18兆欧以上），盛装感受态细胞、质粒、连接产物的离心管，枪头，电转杯都要确保洁净，这些往往容易被国内的操作人员忽视，其实是很重要的。你只要想想1ng的DNA是多么少的一个量的概念就会明白电转的极其敏感性。而污染物是很容易超过这个量而导致电转被干扰的。我曾经连续三次转化率极低，后来我将离心管、枪头全部换用进口的，电转杯用新的，转化效率提高了20倍以上。2 低温。菌摇好以后，从洗菌开始制备感受态细胞的过程中就要尽量避免让菌体温度超过4度。我一般将洗菌的原子级水于前一天晚上放4度冰箱。为避免冰箱温度不能达到4度，我一般会在临用前半小时将水放入－20度冰箱才放心。更好的办法是放到制冰机里埋到冰上冷却一晚上。装新感受态细胞的离心管也要在临用前半小时插到冰上冷却。3 菌株本身的问题。接种时用的菌最好是最近活化的平板上挑的，最好是活化与接菌连续操作，这有两方面的原因：一是放久的平板菌的生理状态会下降，二是放久的平板容易染杂菌。接菌是一定要严格进行无菌操作：先将接种针，培养基和超净台照20分钟，再操作。菌株本身的问题可通过设置阴性对照判断，如果阴性板上长了杂菌，则很可能是接菌或放大时污染了。此外，提高感受态细胞转化效率的途径还可以是18度摇菌，尽管单单放大摇菌时间会要24小时以上，但确实可以提高转化效率。至于连接，仍然是三要素：第一，将vector和insert的摩尔比控制在1比3～8是一般比较合适的比例；第二，vector和insert的洁净程度。不知你的vector和insert是用什么试剂盒纯化的。当然，不管用什么纯化，必须注意不要让加水溶解前还有乙醇残留在硅胶柱子或离心管中是很关键的，残留的乙醇会干扰酶反应已是不争的事实。同时，又不能使你的DNA干透得太久，这样溶解不充分同样使连接失败。第三，洁净的水和离心管、枪头仍是非常值得重视的。如果几次连接失败，而且又可以排除载体和插入片断的问题，我建议换进口的离心管和枪头试一下。这并非本人崇洋媚外，而是国内有些耗材的生产厂家太不注重规范和质量，实在没有其他办法。关于连接，送你一份园子里下载的连接反应心得，望对你有用。
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chpi22 编辑于
非常感谢chpi22您的建议我受益非浅,现在已经筛选到了,谢谢
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