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液相色谱串联质谱仪测定液体乳中雌二醇含量 优先出版
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牛乳中抗菌类药物、雌激素残留检测及其营养素含量的研究
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氘代同位素内标气相色谱-质谱法测定鱼贝类肌肉中β-雌二醇残留
建立了不同鱼贝类肌肉组织中以氘代同位素为内标测定β-雌二醇残留量的气相色谱/质谱(GC/MS)方法.样品中加入内标β-雌二醇-D2 和乙酸钠缓冲溶液匀质后,用乙腈超声提取,经过正己烷脱脂,C18固相萃取柱净化和柱前三甲基硅烷化后,进行GC/MS分析.根据β-雌二醇和内标衍生物保留时间、主要特征离子及其相对丰度和平均质谱图定性;选择离子监测(SIM)模式下,根据β-雌二醇和内标衍生物定量离子质量色谱图的峰面积比值,内标标准曲线法定量.实验结果表明,在0.005～0.25 mg/L范围内,衍生物定量离子峰面积比值与β-雌二醇浓度呈现良好线性关系,相关系数为0.9995;方法定量检出限为0.2 μg/kg.当添加水平为0.2～5.0 μg/kg 时,回收率为68.5%～100.1%,相对标准偏差为4.8%～10.1%.通过对市场上7种鱼贝类的检测,进一步证明该法可实现对样品进行灵敏、准确的定性定量分析.
作者单位：
中国海洋大学食品科学与工程学院,青岛,266003
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核素内标结合固相萃取测定动物肌肉组织中16种同化激素残留
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氘代同位素内标气相色谱?质谱法测定鱼贝类肌肉中β?雌二醇残留
作者：邹龙
江洁&&&&作者单位：中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛 266003
建立了不同鱼贝类肌肉组织中以氘代同位素为内标测定β?雌二醇残留量的气相色谱／质谱（GC/MS)方法。样品中加入内标β?雌二醇?D2 和乙酸钠缓冲溶液匀质后，用乙腈超声提取，经过正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化和柱前三甲基硅烷化后，进行GC/MS分析。根据β?雌二醇和内标衍生物保留时间、主要特征离子及其相对丰度和平均质谱图定性；选择离子监测（SIM）模式下，根据β?雌二醇和内标衍生物定量离子质量色谱图的峰面积比值，内标标准曲线法定量。实验结果表明，在0.005～0.25 mg/L范围内，衍生物定量离子峰面积比值与β?雌二醇浓度呈现良好线性关系，相关系数为0.9995；方法定量检出限为0.2 μg/kg。当添加水平为0.2～5.0 μg/kg 时，回收率为68.5%～100.1%，相对标准偏差为4.8%～10.1%。通过对市场上7种鱼贝类的检测，进一步证明该法可实现对样品进行灵敏、准确的定性定量分析。
【关键词】& 雌二醇，水产品，氘代内标，衍生化，固相萃取，气相色谱?质谱
　　1& 引言
　　雌二醇（ES）是一种天然雌激素，属于甾类同化激素,有&和&两种构型。由于&?雌二醇为生物学效应最强的内源性雌激素而被广泛应用于临床[1]；ＥＳ具有较强的蛋白质同化作用，能促进动物生长，并可使动物单性化，减少过度繁殖，提高产量，而被用于水产养殖业[2]。但&?雌二醇可在动物组织内形成残留，通过食物链进入人体, 易导致儿童性早熟、男孩女性化，致畸致癌[1]等，严重威胁人类的健康。国外有关尿[3]、血[4]、畜禽组织[5~8]中&?雌二醇残留检测的文献报道较多，但未见对水产品，尤其是鱼贝类肌肉组织的专门报道。国内关于动物源性食品中该物质的残留量检测有少量报道[9,10]，且研究对象只限于一种鱼贝类，有其局限性。目前所用的分析方法有放射免疫测定法（RIA）[11]、高效液相色谱法（HPLC）[10]、气相色谱?质谱法（GC/MS）[3~9,12]和液相色谱?质谱法（LC/MS）[13]等。相比较而言，GC/MS法比较适合低浓度水平（&g/kg）雌二醇的分析。采用适当的衍生化技术和选择离子监测（SIM）模式，即使在鱼贝类肌肉组织低目标物浓度、高基质背景的情况下，也能消除背景干扰，改善灵敏度，提高检出限。但目前国内尚没有成熟的针对鱼贝类肌肉组织中&?雌二醇残留检测的GC/MS确证方法。本研究建立了不同鱼贝类肌肉组织中&?雌二醇残留量的GC/MS测定方法。
　　2& 实验部分
　　2.1& 仪器与试剂I气相色谱/质谱联用仪（美国 Agilent公司），配分流／不分流毛细管柱进样器和GC?MS化学工作站；Laborota 4001?efficient旋转蒸发仪（德国 Heidolph公司）；BR4i高速冷冻离心机（法国 Jouan公司）；12通道半自动固相萃取装置（美国 Supelco公司）；氮气浓缩仪(北京康林科技有限责任公司)。&?雌二醇（&?Estradiol，Wako公司），纯度& 97%；&?雌二醇?D2（&?Estradiol?D2, Sigma公司），纯度& 98%；N?甲基?N?三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA，Sigma?Aldrich公司），纯度为99%；二硫赤藓糖醇（DTE，Alfa Aesar公司），纯度为99%；三甲基碘硅烷（TMIS，Fluka公司），纯度&98%；乙腈、甲醇、正己烷均为色谱纯（Fisher公司），其余试剂为分析纯；Cleanert ODS C18固相萃取柱（Agela公司，500 g/3 L，封端）。
　　2.2& 标准溶液配制用甲醇分别配制&?雌二醇和&?雌二醇?D2标准贮备溶液为100 mg/L和200 mg/L，－18℃冰箱避光存放。临用前，分别用甲醇稀释成一系列浓度梯度的&?雌二醇标准工作溶液和0.05 mg/L的内标标准工作溶液。取0.2 mol/L 乙酸钠溶液237 mL 和0.2 mol/L乙酸溶液63 mL，混匀，用冰乙酸调pH，得到0.2 mol/L pH 5.2的乙酸钠缓冲溶液。&&& 分 析 化 学第3５卷第7期邹& 龙等:氘代同位素内标气相色谱?质谱法测定鱼贝类肌肉中&?雌二醇残留&&& 在无水条件下配制衍生化溶液：0.0020 g DTE溶解于1 mL MSTFA，然后在液面下加入2 &L TMIS，混匀，放置过夜后使用，低温避光防潮密封保存。
　　2.3& 样品处理
　　2.3.1& 匀质和提取& 取鱼贝类肌肉组织，用家庭用搅拌器制样后于－18℃冷冻保存备用。准确称取5.00 g试样于50 mL离心管中，加入100 &L内标标准工作溶液及5 mL乙酸钠缓冲溶液, 用匀质器以18000 r/min匀质2次，每次30 s后，加入10 mL乙腈，充分旋涡混合1 min，室温下超声提取15 min。取出离心管，以10000 r/min于4℃离心10 min，上清液倒入另一离心管中。残渣中加入10 mL乙腈，按上述方法再提取一次, 合并上清液。
　　2.3.２& 净化& 加入10 mL正己烷，加塞剧烈振荡1～2 min，以10000 r/min于4℃离心5 min，吸弃正己烷层，下层溶液用正己烷重复洗涤一次，合并离心后的溶液于鸡心瓶。加入0.5 mL正丙醇，于45℃水浴条件下旋转蒸发至干。残渣中加入1 mL乙腈，超声波清洗瓶壁1 min后，吸至5 mL注射器中。再用1 mL乙腈提取一次，合并溶液并经有机系针头过滤器过滤，再用水稀释至10 mL。样液过C18SPE小柱（过柱前，依次用6 mL甲醇、3 mL 0.1%乙酸溶液和3 mL水活化），流速控制在1～2 mL/min。用3 mL水洗涤C18柱，弃掉流出液。然后用9 mL乙腈洗脱，收集洗脱液，氮气吹干。
　　2.3.３& 衍生化& 在残渣中准确加入100 &L MSTFA?DTE?TMIS衍生化试剂，盖紧塞子并旋涡混合1 min，在60℃烘箱中反应30 min，冷却至室温，于48 h内进行气相色谱?质谱分析。进行标准溶液的衍生化时，先吸取雌二醇和内标标准工作溶液于去活样品反应瓶（美国 Agilent公司）中，旋涡混合并氮气吹干，然后同上进行衍生化反应。
　　2.4& 色谱和质谱条件HP?5 MS毛细管柱（25 m&0.32 mm&0.52 &m）；柱初始温度120℃（2 min）15℃/min250℃5℃/min300℃（5 min）；载气He（& 99.999%），流速1.0 mL/min；进样口温度250℃；不分流进样1 &L。EI离子源和四极杆温度分别为230℃和150℃；接口温度280℃；电离电压70 eV；溶剂延迟3 min；电子倍增器电压为1106 V；扫描质量范围为40～500 amu。
　　3& 结果与讨论
　　3.1& 样品处理条件的选择及优化
　　３．１．１& 提取溶剂的选择& 雌二醇难溶于水，在弱极性或中等极性的有机溶剂中有较好的溶解度。尝试用甲醇?缓冲盐溶液、乙腈?缓冲盐溶液、乙腈、氯仿、二氯甲烷、丙酮及乙醚作为提取溶剂。从提取效率来看，除了氯仿和乙醚在80%以下，其余提取溶剂都相差不大，可达95%以上。但考虑到鱼贝类肌肉组织中各种内源性杂质多,蛋白质和油脂含量较高的特点，而乙腈对动物蛋白具有良好的沉淀作用，与其它溶剂相比，对脂类化合物的溶解度较小；实验中发现，在对雌二醇低浓度尤其是接近检出限的样品进行定量时，基质中有与雌二醇基峰离子（m/z 416）相同的碎片离子，严重干扰雌二醇的定量。所以，先加入缓冲液不仅可以调节溶液pH为酸性，使雌二醇保持分子状态，而且把产生干扰碎片离子的碱性物质去除了，便于定量离子的选择。故本方法选用乙腈?乙酸钠缓冲溶液（pH 5.2）作为雌二醇的提取溶剂。
　　3.１．2& C18柱净化&&& 在文献[6,7]中，大多根据杂质的性质采用2～3种不同填料的SPE小柱进行净化。本实验通过优化条件，选用一种填料的SPE小柱，既减少成本，又能达到较好的净化效果。上样前用水进行适当的稀释以降低乙腈的强度，使雌二醇能够保留在SPE小柱上。在其它条件相同的情况下，比较了不同类型、不同种类填料和不同填料量C18固相萃取柱对&?雌二醇回收率的影响，结果见表1。通过比较，最终选择了回收率最高的Cleanert ODS C18固相萃取柱（500 g/3 L，封端）。
　　表1& 固相萃取柱提取效率的比较（略）
　　Table 1& Comparison of the extraction efficiency of different SPE cartridges
　　注（notes）：未封端（not?capped），填料表面存在较多的硅醇官能团，能提供额外的极性相互作用（existence of many silanol functional groups with extra polar interaction on the surface of filler）；封端（capped），则反之（absence of silanol functional groups with extra polar interaction on the surface of filler）。
　　3.1.3& 衍生化条件的选择& 雌二醇及氘代物结构中含有芳环，侧链C3、C17为极性基团，低挥发性，因此不适合直接进行GC/MS分析。常用的解决办法就是将其C3、C17羟基衍生化（硅烷化、酰化和烷基化）为醚类（bis?O?TMS）。实验中选用了七氟丁酸酐（HFBA）、N?甲基?N?三甲基硅基三氟乙酰胺（MSTFA）和MSTFA?TMIS?DTE ３种衍生化试剂进行比较。结果表明，MSTFA?TMIS?DTE能把雌二醇及氘代物的两个羟基定量硅烷化，且衍生化条件温和、速度快、效率高，能得到较强的分子离子峰（见图1）。TMIS作为催化剂，加速衍生化反应；DTE是抗氧化剂，能使衍生化溶液稳定[14]。由于衍生化试剂遇水立即分解，因此在操作中应特别注意防潮。衍生化反应在室温下也能进行，但重复性差[6],参照文献[14]以及实验证明，选择衍生化温度为60℃。在其它条件相同的情况下，将&?雌二醇标准衍生反应不同时间。结果表明，反应时间在20～45 min时，衍生反应比较完全，时间过长，反应副产物增加，比值降低。因此，采用30 min为反应时间。
　　图1& &?雌二醇（a）和&?雌二醇?D2（b）三甲基硅烷化衍生物的结构和EI全扫描质谱图（略）
　　Fig.1& Structure and EI full scan mass spectra of trimethylsilylated &?estradiol（a）and &?estradiol?D2（b）
　　将衍生后的&?雌二醇标准和样品溶液放置不同时间后测定。结果表明，由于基质作用的存在，样品溶液衍生产物稳定性比标准溶液差。标准溶液衍生产物，在96 h内峰面积不显著变化；而样品溶液衍生产物，尽管不同浓度之间峰面积变化没有明显差异，但都在48 h后，有或多或少的降低。因此，衍生反应后，尽量在48 h内进行气相色谱?质谱分析。
　　3.2& GC?MS分析结果 为了使目标峰与试剂及其它干扰因素峰分开，采用程序升温进行GC色谱分离（见图2?1），MS提高检测的选择性和灵敏度。尽管如此，在全扫描模式总离子流色谱图（TIC）上，由于鱼贝类肌肉组织本底基质复杂，加上目标化合物浓度很低，峰形不好，甚至被本底掩盖。为此，实验在SIM模式下通过提取离子流色谱图（extracted ion chromatography）对目标化合物进行追踪，消除很大一部分的背景干扰，利用保留时间和衍生物主要特征离子及其相对丰度进行定性分析（见表2）。虽然&?雌二醇/&?雌二醇?D2衍生物在全扫描TIC上不能基线分离，但可以通过两者的特征碎片离子，在SIM模式下利用质量色谱图对它们进行&分离&和准确定量。如图2?2和图2?3所示，&?雌二醇/&?雌二醇?D2衍生物定量离子没有受到样品基质碎片离子的干扰，峰形良好，显著提高了信噪比。
　　表2& SIM模式下&?雌二醇和&?雌二醇?D2衍生物及其特征诊断离子（略）
　　Table 2& Derivatives of &?estradiol and &?estradiol?D2 and their diagnostic ions acquired in selected ion monitoring（SIM）mode
　　[M]+& ?：括号内为相对强度（the number in parentheses is relative intensity)。ＴＭＳ： trimethylsilyl．
　　图2& 标准及样品色谱图（略）
　　Fig.2& Chromatograms of standards and samples
　　1． 全扫描模式下&?雌二醇和&?雌二醇?D2标准溶液的总离子流色谱图（total ion chromatogram of standard &?estradiol and &?estardiol?D2 in full scan mode）； 2． 选择离子模式下添加于鲫鱼肉中&?雌二醇（5 &g/kg）衍生物定量离子的质量色谱图（extracted ion chromatogram of a crucian meat sample spiked with 5 &g/kg &?estradiol in SIM mode）； 3． 选择离子模式下添加于鲫鱼肉中&?雌二醇?D2（1& &g/kg）衍生物定量离子的质量色谱图（extracted ion chromatogram of a crucian meat sample spiked with 1 &g/kg &?estardiol?D2 in SIM mode）。
　　3.3& 方法评价实验采用内标标准曲线法定量。配制浓度为0.005、0.01、0.03、0.05、0.1和0.25 mg/L &?雌二醇标准溶液，取100 &L不同浓度的该标准溶液，分别加入100 &L内标标准工作溶液，衍生化，GC/MS测定后，以雌二醇与内标衍生物的定量离子峰面积比值为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作图，得到内标标准工作曲线。结果表明，&?雌二醇在浓度为5～250 &g/L的范围内呈良好的线性关系，线性方程为y=12.623x+0.1741, 相关系数为0.9995。
　　以空白样品加标，S/N＝10所对应的&?雌二醇的浓度求得方法定量检出限为0.2& &g/kg。在空白鱼贝类肌肉组织基质（鲅鱼、鲫鱼、刀额新对虾）中进行３个浓度水平的添加回收实验，结果见表3。
　　表3& &?雌二醇在不同鱼贝类肌肉组织基质中的回收率（略）
　　Table 3& Ｒecoveries of &?estradiol in muscle tissue matrices of different fishes/shellfishes
　　3.4& 样品分析为考察本方法的适用性，按上述实验方法对市售的鲜活鱼贝类进行了抽检，样品包括鲫鱼、鳗鱼、草鱼、鲤鱼、鳕鱼、鲅鱼和刀额新对虾。结果显示，除雌性刀额新对虾外，其它６种鱼贝类肌肉组织中均未检测出&?雌二醇。
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