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广谱型抗原蛋白gapdh的免疫保护机制分析及保护效果关键区域的定位
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广谱型抗原蛋白gapdh的免疫保护机制分析及保护效果关
官方公共微信我要做CTGF和BMP-7的反转录RT-PCR,引物如何设计?内参怎么选择?GAPDH和b-actin哪个能用?
我要做CTGF和BMP-7的反转录RT-PCR,引物如何设计?内参怎么选择?GAPDH和b-actin哪个能用?
可以去影响因子较高的文献里找,然后去pubmed中blast一下就好；也可以用引物设计软件合成,合成原则在网上都可以找到的,合成好了也要blast.两个都是看家基因,均可作为内参,我们实验室用的是GALDH
与《我要做CTGF和BMP-7的反转录RT-PCR,引物如何设计?内参怎么选择?GAPDH和b-actin哪个能用?》相关的作业问题
Oligo dt不需要设计,用试剂盒里面的就行.如果你RT的引物想用自己的,那你需要扩增的基因序列应该是明确的吧.RT的时候'引物没太多的选择性,mRNA序列跟反义链配对,因此RT的引物要根据正义链 （就是通常描述基因序列的那条链）3'末端往5'末端的顺序来合成.需要注意通过控制引物的长度,控制Tm,毕竟反转录反应都在
不,需要两条,因为随着你PCR的进行,另一条互补链会被引物扩增出来,因此你需要两条引物都加进去. 再问： 那么我引物设计的时候，是不是以mRNA为模版与以CDNA为模版设计的引物都可以？ 再答： 都可以，别忘记是T不是U。
通常文献中说的RTPCR是指反转录PCR,实时定量一般说RealtimePCR...
都要最好,RT-PCR的电泳图直观定性,一目了然,再配一个real time PCR的bar图,其统计性好,定量程度高.editor当然希望你两个图都有啊.如果非要选择一个的话,real time PCR是现在主流,毕竟是定量的实验
RT-PCR一般指的是反转录PCR.
我知道和使用过的U6内参基因只有两个：RNU6-1和RNU6-2.前一个就是常见的u6,后一个有时被称为u6b.在我的大鼠RNA样本当中,u6表达量有些太高,u6b的Cq值与我的目标miRNA比较接近,稳定性也很好.但是这些对植物样本中的内参基因选择没有什么指导意义.为了确定u6在植物中的保守性,比较快捷的办法是找到谈
PCR这里是指常规的PCR吧?就是以DNA为模板,dNTP为原料,在Taq DNA聚合酶的作用下,扩增DNA.RT-PCR即Reverse transcription-PCR,顾名思义就是讲mRNA通过反转录成第一链cDNA后,以第一链cDNA为模板进行PCR.
你找带有8,1字样的
跟一般的PCR一样哇,Primer Premier、Oligo都可以哦.
呃……PCR知道吧?polymerase chain reaction聚合酶链式反应Taq PCR应该就是用普通的Taq DNA聚合酶的PCRRT PCR有的时候指reverse trascription PCR,逆转录PCR.有时指real-time PCR,实时荧光定量PCR.LD PCR指long-distanc
我也遇到过这种问题,个人觉得可能是目的基因的定量引物不好,还有就是要优化PCR条件!
引物加的量应该相同,能放在一管里跑最好,但是分开跑也可以接收（一般都是这样）
咱们中国最低温度也就那么低,你那种管道的管径就那种.22W足以.你可以买12米左右电伴热带,建议买合资.或者质量好点的,逼近就10M.然后需要一个电源接线盒.首段.尾端.一卷耐高温聚酯纤维胶带,一个不锈钢帮扎带.即可.如有问题请追问了亲.
说的是集成运放,应该是说用集成运放的芯片做功能模块,因为每个运放要工作都有外围的电路,一个模块就是把这些外围电路加上做的小型电路上图就是一个用OPA695集成运放设计的高频放大电路模块 再问： 多谢！那像这样的应用实例主要有哪些？像振荡器，有源滤波器，比较器这些算么？ 再答： 算，因为集成运放都需要外围电路才能工作，通
单链的cDNA在和其中一个引物反应后,不就形成双链了吗?当然和天然的双链还是有区别的,就是在引物结合部位的上游还是单链.所以反转录PCR的引物设计就是把cDNA当做双链一样进行的. 再问： 是的。我脑子短路了。
RT-PCR就是将RNA先反转录为cDNA,在将转录得到的cDNA作为模板进行PCR反应扩增目标片段.用于反转录的引物根据实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT及基因特异引物的一种.对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA三种都可.随机引物：适用于长的具有发卡结构的RNA.适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有
有时候溶解曲线看上去是很特异的,而电泳却能跑出两条带；加内参是为了做表达比对,跟内参比,这样才能知道是高表达还是地表达,也可以作为判断PCR反应过程是否顺利的依据.
你首先要设计actin的引物,根据引物的GC含量确定退火温度,这个在设计引物的软件上可直接给出,至于变性和延伸跟其他基因的PCR程序没啥区别.要P出来很清晰的一条带,并且和你设计的那段长度是一样的,说明反转录是成功的.
首先,RT不是证明RNA有无表达的很好方法,RT批不出来会有很多原因,并不仅仅是没有模板.建议你做northern.做RT需要1,很干净整洁的实验环境,RNA提取对操作环境的要求很高.2,电动组织分散仪（IKA公司的T10那种）或研钵+液氮或玻璃组织研磨器,以上提取效果递减.3,1.5ml管冷冻离心机.4,移液枪1ml关注今日：21 | 主题：285755
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【求助】荧光定量PCR检测时GAPDH和目的基因必须放在同一板中吗？
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这个帖子发布于9年零136天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
我知道最好荧光定量PCR检测时GAPDH和目的基因放在同一板中。但我有30个样本，一式3孔就占了90孔，我不知道是应该一个整96孔板做GAPDH,下一个板子做目的基因；或者一个板子中检测数个样本的GAPDH+多个目的基因，分几个板子作？我现在有几个基因要检测，实在不知道哪一个方法才是正确的。各位高手，知道有什么文献报道关于这方面的吗？先谢了！！！！
不知道邀请谁？试试他们
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多谢楼上两位的解疑！！！！
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关于丁香园> PCR内参：选还是不选？
导读：内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。常用的PCR内参有GAPDH 、β- actin 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因 等。本专题就PCR实验中遇见的有关于内参的一些问题作出总结，以供读者参考。
PCR内参基因介绍
PCR内参基因介绍
目前基因表达的转录分析多采用单一看家基因作为内参来校正目标基因的表达量.实验中以人肝癌BEL-7402细胞为研究对象，应用
通过基因克隆和序列测定,获得了海带( Laminaria japonica) 配子体的18S rRNA 基因序列,其长度为1 716bp ,GenBank 登录号为EU293553。以蓝
　目的　获取白纹伊蚊β2肌动蛋白基因序列并探讨其作为基因表达内参照的作用。　方法　根据昆虫β2肌动蛋
白核苷酸序列
包括GAPDH 、β- actin(BETA-actin) 、18sRNA、28sRNA 、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因 等。
常用的β-actin 引物序列
引物应该用TE稀释。oligo在酸性条件下是不稳定的，容易降解，如果用水溶解引物，无法保证pH值，如果合成引物纯化不好，造
PCR内参常见问题汇总
PCR内参常见问题汇总
实时定量PCR试验中，内参对于实验具有重要意义。常用的内参基因也有好几种，那么在实验中应该选择哪个作为内参基因，选
做RT-PCR检测时，内标该怎么样去确定?有的书上说用18SrRNA做为内标，所有的植物都可以适用吗?如果要自己去设计内参，要怎样
如果marker和对照都有，只能说明是你没有P出东西，看看是不是模板问题，PCR条件再摸索下吧。
我现在在做RT-PCR，请问大家内参的作用是什么??是不是我的每个标本都要做内参??内参可以加在样本的试管里一起P吗??我用的
做相对定量RT-PCR时，需要选择管家基因做参比，可是管家基因到底怎么选择啊?比如我要做瘤胃内某种细菌的RT-PCR，怎么选择
我做RT-PCR，用B-actin做内参，产物464bp，目的基因产物218bp。电泳时内参部分有两条亮带。500之前有一亮带，500之后还有一 亮带
请教RT-PCR内参的种类及各自的应用范围?特别是GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)和actin这两个内参照物。欢迎介绍有关的书目或资料。
在做定量PCR时，比如有的文献中说用的是β-actin，为什么又的用的是β-tublin，或者还有做植物的时候，他们会选择18s等，这些
我最近做定量，做出的目的基因的CT值33，34 或检测不出来。但内参基因的CT值在17或18左右。而这个基因我在半年前做的时候
1、我想做不同耐药水平的菌株的同一毒力因子的表达量的差异比较，是做半定量好呢还是做实时荧光PCR绝对定量?2、半定量的
问个定量PCR问题：绝对定量与相对定量有什么区别?目的分别是什么?
Copyright(C) All Rights Reserved粤ICP备号-3籽鹅不同发育时期和不同组织内参基因选择的研究--《黑龙江八一农垦大学》2011年硕士论文
籽鹅不同发育时期和不同组织内参基因选择的研究
【摘要】：为筛选不同发育时期籽鹅不同组织中最佳的内参基因,本试验分别以1日龄、2月龄、4月龄、6月龄和8月龄籽鹅的心脏、肝脏、肾脏、肌肉和卵巢组织为研究对象,应用反转录实时定量聚合酶链式反应(Real-time reverse transcription quantitative PCR, qRT-PCR)检测7个候选内参基因ACTB、GAPDH、18S rRNA、28S rRNA、SDH、HPRT1和TUB的表达情况,然后分别使用geNorm和NormFinder程序进行数据分析,最终筛选出最佳的内参基因及数目。
分别在1日龄、2月龄、4月龄、6月龄和8月龄籽鹅五种组织间进行7个候选内参基因的qRT-PCR分析,经geNorm程序分析后根据7个候选内参基因表达稳定度平均值(M)对其稳定性从大到小进行排序。具体的排序分别是:1日龄:GAPDH/HPRT128S rRNATUBSDHACT18S rRNA;2月龄:HPRT1/28S rRNAGAPDH18S rRNAACTBTUBSDH;4月龄:GAPDH/28S rRNAHPRT1SDH18S rRNAACTBTUB;6月龄:GAPDH / HPRT1TUB28S rRNA18S rRNAACTBSDH;8月龄:GAPDH/28S rRNAACTBTUBHPRT1SDH18S rRNA。且七个候选内参基因的V2/3(配对差异分析)分别为0.129、0.051、0.080、0.084、0.069,内参基因的最适数目均为2个。进一步用NormFinder程序对数据进行验证分析,筛选出相对稳定的内参基因分别为GAPDH和HPRT1(1日龄)、HPRT1和28S rRNA(2月龄)、GAPDH和28S rRNA(4月龄)、GAPDH和HPRT1(6月龄)、GAPDH和28S rRNA(8月龄),与geNorm程序分析结果一致。
分别在籽鹅心脏、肝脏、肾脏、肌肉和卵巢组织的五个不同发育时期进行七个候选内参基因的qRT-PCR分析,经geNorm程序分析对其稳定性从大到小进行排序。具体的排序顺序分别为:心脏:GAPDH/28S rRNASDHACTB18S rRNAHPRT1TUB;肝脏:GAPDH/HPRT1SDHTUB 28S rRNA18S rRNAACTB;肾脏:ACTB/SDHGAPDHHPRT128S rRNA18S rRNATUB;肌肉:HPRT1/18S rRNAGAPDH28S rRNASDHACTBTUB;卵巢:GAPDH/HPRT1SDHTUB18S rRNAACTB28S rRNA。且七个候选内参基因的配对差异分析为:心脏V4/5= 0.210、肝脏V2/3=0.237、肾脏V3/4=0.148、肌肉V2/3=0.124、卵巢V2/3=0.152,内参基因的最适数目分别为4个、2个、3个、2个和2个。进一步用NormFinder程序对数据进行验证分析,筛选出相对稳定的内参基因分别为28S rRNA、SDH、GAPDH和HPRT1(心脏)、GAPDH和HPRT1(肝脏)、ACTB、SDH和GAPDH(肾脏)、HPRT1和18S rRNA(肌肉)、GAPDH和HPRT1(卵巢),与geNorm程序分析结果基本一致。
通过上述结果表明:1日龄和6月龄籽鹅五种组织间进行qRT-PCR分析中相对合适的内参基因为: GAPDH和HPRT1;4月龄和8月龄相对合适的内参基因为:GAPDH和28S rRNA;2月龄相对合适的内参基因为:HPRT1和28S rRNA。
在不同发育时期的籽鹅心脏组织qRT-PCR分析中相对合适的内参基因为:GAPDH、28S rRNA、SDH和HPRT1;肝脏中为:GAPDH和HPRT1;肾脏中为:ACTB、SDH和GAPDH;肌肉中为:HPRT1和18S rRNA;卵巢中为:GAPDH和HPRT1。
【关键词】：
【学位授予单位】：黑龙江八一农垦大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2011【分类号】：S835【目录】：
Abstract4-9
英文缩写词表9-10
第一章 文献综述10-23
1.1 鹅类简介10-12
1.2 籽鹅简介12
1.3 定量PCR 技术简介12-13
1.4 实时荧光定量PCR13-19
1.5 内参基因在实时定量PCR 中应用19
1.6 内参基因应具备的条件19-20
1.7 最常用的两种内参基因20-21
1.8 内参基因稳定性的分析方法21
1.9 内参基因的选择21
1.10 本研究的目的意义与主要内容21-23
第二章 材料与方法23-33
2.1 材料23-24
2.2 方法24-33
第三章 试验结果33-43
3.1 总RNA 的提取33
3.2 七种持家基因PCR 扩增33-34
3.3 重组质粒的双酶切鉴定34
3.4 基因表达的标准曲线及PCR 扩增效率34-36
3.5 实时定量PCR 溶解曲线分析36-37
3.6 内参基因稳定性比较37-43
第四章 讨论43-45
4.1 总RNA 的提取与检测43
4.2 qRT-PCR 反应条件的优化43-44
4.3 geNorm 内参基因稳定性分析程序44
4.4 最适内参基因的选择44-45
第五章 结论及创新点45-46
5.1 结论45
5.2 创新点45-46
参考文献46-51
作者简历53
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