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的产物长度800bp，QPCR能做吗？
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q-PCR产物一般300bp以内
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风抹微云 发表于
q-PCR产物一般300bp以内
我设计了一对引物，扩增产物大约750bp，想用qPCR检测表达量。我做过一次qPCR，结果也出来了，但是没有做引物扩增效率检测，请问我还需要做吗？
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murongxiaoxiao大叔级摄影爱好者，喜欢分享绝对零度积极有责任心，热心公益事业yiii红米达人，爱拍照的北京女孩您现在的位置：&&>&&>&&>&&>&正文
浅谈Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的PCR分析
来源：　 11:00:00　【】　
1.2.5& lovB扩增片段的克隆与测序&& 　　回收及克隆红曲的lovB引物扩增产物中约750 bp的片段，其中连接反应液成分为pMD18T载体1 μL，PCR产物4.5 μL，含T4连接酶和连接酶缓冲液的solutionⅠ5 μL，在16 ℃连接2 h。大肠杆菌DH5α感受态的制备及转化均按分子克隆指南方法操作。克隆的片段交由TaRaKa公司完成测序。 　　2& 结 果 1& 以基因组DNA进行扩增反应的结果,见图1。 　　图1表明第1组引物对lovB的扩增得到了预期的产物(745 bp)，而第2组和第3组引物对lovC和lovE的扩增均未得到预计的产物。 2& lovB扩增片段测序结果 　　回收约745 bp的片段，并进行测序。经与土曲霉洛伐他汀合成酶基因对比，序列完全相同，序列如下，其中阴影部分是引物序列。&& 　　3& 讨 论 1& lovB相关的第一组引物的设计及结果分析 　　& 　　第1组引物参考了Thomas等［10］针对土曲霉lovB（长度约11 kb）中KS功能域设计的引物，Thomas等在设计引物的过程中参考了土曲霉产生洛伐他汀酶基因序列及其他真菌的聚酮合成酶基因和真菌的脂肪酸合成酶基因，使其不易扩增出其他相似功能的基因。其原设计的引物为正向5’TTT CAT GCI GCI TTT TTT AA3’；反向5’ATG ATT IGG CAT ICT IAT TCC 3’。本文根据这两段引物及土曲霉lovB基因相关序列设计出第1组引物。从测序结果来看，表明本文中所用的红色红曲霉基因组中有与土曲霉lovB中相关序列一致的745 bp的序列，它很可能就是红色红曲霉中洛伐他汀合成酶基因簇中的一部分。 2& lovC相关的第2组引物的设计和lovE相关的第3组引物的设计 　　土曲霉洛伐他汀合成酶基因中的LDKS长度约为43 kb，含有lovC和lovE等功能域。 　　第2组和第3组引物是以primer 3程序根据土曲霉洛伐他汀合成酶基因lovC和lovE设计的引物，在设计过程中避开了内含子。但在本实验中未得到预期扩增片段，可见在红色红曲霉和土曲霉中的这2个基因差异较大。 3& 3组引物与新发现的丛毛红曲霉的洛伐他汀合成酶基因簇［8］的电子PCR分析 　　从丛毛红曲霉中得到的洛伐他汀基因簇长度约45 kb，Genebank 序列号为DQ176595，含有mkAmkI等9个功能域，其中mkA和mkB是聚酮合成酶功能域，其他功能域与LDKS类似，但不含烯酯酰还原酶功能域。3组引物都未能从找到匹配序列，也即没有扩增产物。 　　洛伐他汀生物合成过程复杂，其合成酶基因簇庞大，不同红曲霉洛伐他汀合成酶基因有较大的差异，本文PCR扩增的片断可作为克隆Monascus ruber 5031洛伐他汀合成酶基因的探针。 　　参考文献: 　　［1］AUER J,EBER B. A clinical focus on statins［J］. Curr Opin Investig Drugs，):382. 　　［2］DICHTL W,DULAK J,FRICK M ，et al. HMGCoA reductase inhibitors regulate inflammatory transcription factors in human endothelial and vascular smooth muscle cells［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol，):58. 　　［3］ZHONG W B,WANG C Y,CHANG T C. et al. Lovastatin induces apoptosis of anaplastic thyroid cancer cells via inhibition of protein geranylgeranylation and de novo protein synthesis［J］. Endocrinology，): 3 852. 　　［4］张萍,糜漫天,韦娜,等. 洛伐他汀对MCF27细胞pRb蛋白表达及增殖功能的影响［J］. 中国公共卫生,):1198. 　　［5］HENDRICKSON L,DAVIS C R,ROACH C,et al. Lovastatin biosynthesis in Aspergillus terreus : characterization of blocked mutants,enzyme activities and a multifunctional polyketide synthase gene［J］. Chem Biol，. 　　［6］KENNDY J，AUCLAIR K，KENDREW S G,et al. Modulation of polyketides synthase activity by accessory proteins during lovastatin biosynthesis［J］. Science, 368. 　　［7］SUTHERLAND A,AUCLAIR K,VEDERAS J C. Recent advances in the biosynthetic studies of lovastatin［J］. Current Opinion in Drug Discovery and Development,): 229. 　　［8］CHEN Y P,LIAW L L,WANG C L,et al. Monascus pilosus monacolin K biosynthetic gene cluster,complete sequence. Direct Submission (23AUG2005)［DB］. 序列号：DQ176595，Genebank［］.& 　　［9］蔡晶晶. 透明颤菌血红蛋白基因在洛伐他汀产生菌土曲霉中的表达［D］. 中国农业大学博士学位论文,2000.& 　　［10］THOMAS P N,BRAIN A M R,MIKE D,et al. Design and utility of oligonuxleotide gene probes for fungal polyketide synthases［J］. Chemistry & Biology,): 157.&&&2&&&
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Copyright & 2004-
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中国科学院研究生院权威支持(北京)　电 话：010-　传 真：010-MARINE BACTERIA COLD-ADAPTED PROTEASE AND ENCODED GENE AND APPLICATION THEREOF
WIPO Patent Application WO/
Disclosed are a marine bacteria cold-adapted protease and an encoded gene and an application thereof. An amino acid sequence of the cold-adapted protease in the present invention is shown in SEQ ID NO.2. A gene of the cold-adapted protease is encoded, and a nucleotide sequence thereof is shown in SEQ ID NO.1. The present invention provides a new cold-adapted protease gene hspa1 for encoding a gene of a cold-adapted protease HSPA2 and a cold-adapted protease HSPA2 encoded by the same. The cold-adapted protease HSPA2 has excellent cold adapted performance and has wide use in protein hydrolysis.
Inventors:
ZHANG, Si (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
YANG, Jian (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
LI, Jie (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
MAI, Zhimao (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
TIAN, Xinpeng (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
YIN, Hao (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
Application Number:
Publication Date:
12/05/2013
Filing Date:
06/20/2012
Export Citation:
SOUTH CHINA SEA INSTITUTE OF OCEANOLOGY, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
ZHANG, Si (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
YANG, Jian (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
LI, Jie (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
MAI, Zhimao (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
TIAN, Xinpeng (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
YIN, Hao (No.164, West Xingang Road Haizh, Guangzhou Guangdong 1, 510301, CN)
International Classes:
C12N9/52; C12N1/15; C12N1/19; C12N1/21; C12N15/57; C12N15/63; C12P21/06; C12R1/07
View Patent Images:
&&&&&&PDF help
Foreign References:
Other References:
CHEN, XIULAN ET AL.: 'Study on the Different Cold-Adapted Protease Produced by the Deep-Sea Psychrotrophic Bacterium Pseudomonas sp. SM9915' OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA vol. 34, no. 2, 31 March 2003, ISSN X pages 155 - 159
DATABASE GENBANK 05 October 2006 Database accession no. BAD13318.1
Attorney, Agent or Firm:
GUANGZHOU KEYUE I.P.LAW OFFICE (Suite 101/103, 1/F Building 9,No.100,Xianlie Central Road, Yuexi, Guangzhou Guangdong 0, 510070, CN)
权 利 要 求
、 一种适冷蛋白酶， 其特征在于， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示。
、 一种编码权利要求 1所述的适冷蛋白酶的基因。
、 根据权利要求 2所述的编码适冷蛋白酶的基因， 其特征在于， 其核苷酸序列 如 SEQ ID N0.1所示。
、 一种表达载体， 其特征在于， 含有权利要求 2或 3所述的编码适冷蛋白酶的 、 一种含有权利要求 4所述的表达载体的微生物。
、 权利要求 1所述的适冷蛋白酶在蛋白质水解中的应用,
Description:
一种海洋细菌适冷蛋白酶及其编码基因和应用 技术领域：
本发明属于生物技术领域， 具体涉及一种克隆自海洋细菌 HalobaciUiis sp. SCSIO 20089的、 能用于蛋白质水解的适冷蛋白酶及其编码基因和应用。 背景技术：
2010年世界工业酶的市场销售额为 33亿美元， 据估计在未来五年内会以平 均每年 6%的速度增长， 即到 2015年可达到 44亿美元。 适冷酶因其在低温条件 下比中温高温酶具有更高的催化活力，在当今提倡增效节能的背景下越来越受到 研究者的关注。海洋占据了地球表面的 70%，海洋拥有着与陆地迥然不同的生态 环境， 如低温、 高压、 特殊的光照条件等。 据报道在任何纬度下， 距海水表面 1000m 以下的温度不会超过 5 °C ， 这就意味着深海或者海底沉积物环境中的微 生物是产适冷酶的重要来源。
蛋白酶催化蛋白质肽键的水解， 占据了工业酶市场份额的近 60%， 在洗涤、 皮革、食品、医药等行业都有广泛的应用。蛋白酶广泛存在于动植物及微生物中， 其中微生物蛋白酶因活力高易于规模生产被研究得最多。海洋沉积物中的微生物 分泌的蛋白酶在整个生态系统氮循环中对海洋有机大颗粒蛋白的水解过程起着 关键的作用， 常年生活在海底沉积物中的微生物为了适应环境， 进化出能分泌在 低温下高效水解体外大分子蛋白质酶类的能力，因而海洋沉积物是挖掘产适冷蛋 白酶微生物的优良资源。 发明内容：
本发明的第一个的目的是提供一种新的适冷蛋白酶及其编码基因。
本发明的适冷蛋白酶， 其特征在于， 其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示。 本发明的编码适冷蛋白酶的基因， 其特征在于， 编码氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示的适冷蛋白酶的基因：
所述的编码适冷蛋白酶的基因优选， 其核苷酸序列如 SEQ ID N0.1所示。 本发明的第二个目的是提供一种表达载体，其特征在于， 含有上述编码适冷 蛋白酶的基因。 本发明的第三个目的是提供一种含有上述表达载体的微生物。
本发明的第四个目的是提供适冷蛋白酶在蛋白质水解中的应用。
本发明利用兼并引物 PCR， TAIL-PCR从海洋细菌 Halobacillus sp. SCSIO 20089基因组 DNA中扩增获得编码适冷蛋白酶的适冷蛋白酶基因 hspal ,其核苷 酸序列如 SEQ ID N0.1所示， 共有 1590个核苷酸组成， blastn结果显示该基因 序列与数据库中公布基因无显著相似性。按照密码子原则推测其编码的适冷蛋白 酶 HSPA2,其氨基酸序列如 SEQ ID N0.2所示，由 529个氨基酸组成，使用 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索 GenBank数据库，与适冷蛋白酶 HSPA2催化功 能域相似性最高的为越南芽孢杆菌 ( Bacillus vietnamensis ) 的 M4 家族蛋白酶 BWMP (序列号为 BAD13318 ) , 其一致性为 54%。 用组件结构研究工具 Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/search)分析来源于海洋细菌 Halobacillus sp. SCSIO 20089的适冷蛋白酶 HSPA2的组件结构，结果显示自 N端的第 1?25位氨基酸为 信号肽，自 N端的第 75?125位氨基酸为 Thermolysin蛋白酶前导肽的 Fungalysin 区序列， 自 N端第 136-221位氨基酸为蛋白酶前导肽的 YPEB功能域， 自 N端 的第 225-377位氨基酸为 Thermolysin金属蛋白酶的催化域序列，自 N端 379-528 位氨基酸为 Thermolysin金属蛋白酶的 alpha螺旋区序列。
将适冷蛋白酶基因 hspal 与表达载体 pWB980连接， 再转入枯草芽孢杆菌 WB600中表达重组产物适冷蛋白酶 HSPA2进行酶活的测定和酶学性质测定， 结 果表明适冷蛋白酶基因 hspal的表达产物适冷蛋白酶 HSPA2能够水解酪蛋白， 其酶比活为 3077 U/mg蛋白。 该适冷蛋白酶 HSPA2的酶学性质如图 5和图 6所 示， 从图 5和图 6可以看出， 本发明的适冷蛋白酶 HSPA2在低温下也具有较好 的酶活性， 其最适作用温度为 35 °C， 最适作用 pH值为 8.0。
综上所示， 本发明的适冷蛋白酶 HSPA2是一种在低温下也具有较好活性的 新的蛋白酶， 其编码基因一适冷蛋白酶基因 fepW也是一种新的基因。
本发明提供了一种新的编码适冷蛋白酶 HSPA2 的基因适冷蛋白酶基因 hspal及其编码的适冷蛋白酶 HSPA2, 该适冷蛋白酶 HSPA2具有优良的适冷性 能， 在蛋白质的水解中具有广泛的用途。
用于本发明的海洋细菌 Hflfobfld/to sp. SCSIO 20089为本发明人所在实验室 从海洋沉积物中分离得到并保藏， 但已经公开于非专利文献一 UNIPROT数据库 中， 分类识别号 （Taxon identifier) : 1151003 , 学名 （ Scientific name ) Halobacillus sp. SCSIO 20089, 链接网页〗 : A^ t:^g; 3/4
:^Mimx 丄 S1Q ≤。 本申请人 保证自申请日起 20年内向公众提供该海洋细菌 Hfltobfld//i<< sp. SCSIO 20089。 附图说明：
图 1为 PCR产物电泳图， 其中 M为 Marker, 1为 PCR产物；
图 2为质粒双酶切产物电泳图，其中 Ml和 M2为 Marker, 1为质粒双酶切产物； 图 3为适冷蛋白酶基因 hspal 在枯草杆菌 WB600中表达的平板照；
图 4为适冷蛋白酶 HSPA2的纯化电泳图， 其中 1为 Marker, 2和 3为纯化后的 适冷蛋白酶 HSPA2纯酶液；
图 5为适冷蛋白酶 HSPA2的最适作用温度的测定；
图 6为适冷蛋白酶 HSPA2的最适作用 pH的测定。 具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。
在本发明的实施例中所用到的材料包括： Bacillus subtilis WB600、 表达载体 pWB 980为市售产品， LA taq酶， pMD 18-T载体， 限制性内切酶购自 TaKaRa 公司， 胶回收试剂盒购自 OMEGA公司。
实施例 1 :
1、 HfltobfldZ/ s sp. SCSIO 20089基因组 DNA的提取
参考 《分子克隆实验指南》
( 1 ) 培养 5ml海洋细菌 Halobacillus sp. SCSIO 20089的培养物， 取 1ml 的培养物 12000rpm离心 2min， 收集菌体；
( 2 ) 菌体沉淀物中加入 567μ1 TE buffer中，反复吹打使之重悬。加入 30 μ? 20mg/ml溶菌酶， 37°C水浴
( 3 ) 加入 300 μ? 10% SDS和 30 μ? 20mg/ml 蛋白酶 K， 混匀， 37°C水浴
( 4 ) 加入 100 μ? 5Μ NaCl, 充分混匀， 再加入 80 μ? CTAB/NaCl溶液， 混 匀， 65度水浴 lO ( 5 ) 分别加入等体积酚 /氯仿， 氯仿溶液抽提一次；
( 6) 加入 0.6倍体积异丙醇， 轻轻混合， 12000 rpm离心 5 min， 弃上清， 70%乙醇洗涤两次， 超净台风干；
( 7) 加入 50 μ? ΤΕ 缓冲液， 4°C过夜溶解 DNA， 由此得到海洋细菌 Halobacillus sp. SCSIO 20089的基因组 DNA， 保存备用。
2、 兼并引物 PCR克隆适冷蛋白酶基因 hspal的部分序列
根据芽孢杆菌属 M4家族蛋白酶保守氨基酸设计两条兼并引物
20089thermysin-sense: C AGATGGTGTACGGCGAYGGNGAYGG；
20089thermysin-antisense： CGCGGAGTTGGCGCCRTANAR TC , 以 20089thermysin-sense， 20089thermysin-antisense为弓 |物， Halobacillus sp. SCSIO 20089基因组 DNA为模板， PCR扩增。 PCR反应条件为， 94 °C， 5 94 °C， lmin, 55 °C， lmin, 72 °C , 2 min, 30个循环； 72 °C， 延伸 10 min。 获得约 400bp的片段， 胶回收纯化后连接 pMD18-T载体进行测序， 同源比对发 现获得 437bp序列与 Genebank中芽孢杆菌属的中性蛋白酶有较高的相似性。
3、 利用 TAIL-PCR克隆适冷蛋白酶基因 hspal的全基因
根据已获得的 437bp的基因序列分别设计 3条特异性的引物以扩增 5'端序列 (-1： 5 ' -GGCGTTAAATAAAC AGTTAGTGC ACGATAGTA-3 '； -2： 5 '-TGGTATGGACGCCACCCCAGTC；
-3, 5 '-GGTAGATTCTGATACTCATCCATAGAATCCGG-3 ' ) 和两条 3'端特异性引物
(-1： 5'-GACTGGGGTGGCGTCCATACCA-3'；
-2, 5 '-TACTATCGTGCACTAACTGTTTATTTAACGCC-3 ' )； TAIL-PCR所用的通用引物为：
AD- 1： 5 ' -ACGATGGACTCCAGAGVNV NNGGAA-3 '；
AC1 : 5 '-ACGATGGACTCCAGAG-3 '
经过两组 TAIL-PCR后，分别获得约 1500bp和 300bp的片段，连接 pMD18-T 载体测序， 与前面获得的 437bp片段拼接成完整的适冷蛋白酶基因 fepW， 适冷 蛋白酶基因 hspal的核苷酸序列如 SEQ ID N0.1所示。
4、 适冷蛋白酶基因 fepW的核苷酸序列分析 用 NCBI(National Center for Biotechnology Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的软件如 ORF finder, Blast对 DNA序列进行分析。 适冷蛋白酶基因 fepW的开放阅读框由 1590个脱氧核苷酸组成，序列如 SEQ ID NO.l所示， 其中起始密码子为 ATG， 终止密码子为 TAA。 blastn结果显示该基 因序列与数据库中公布基因无显著相似性。
5、适冷蛋白酶基因 fepW的编码产物适冷蛋白酶 HSPA2的氨基酸序列分析 适冷蛋白酶基因 hspal 编码一个含 529 个氨基酸的蛋白质一适冷蛋白酶 HSPA2 ， 其 氨 基 酸 序 列 如 SEQ ID N0.2 所 示 ， 使 用 Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索 GenBank数据库，与适冷蛋白酶 HSPA2催化功 能域相似性最高的为越南芽孢杆菌 ( Bacillus vietnamensis ) 的 M4 家族蛋白酶 BWMP (序列号为 BAD13318 ), 其一致性为 54%。
用组件结构研究工具 Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/search)分析来源于海洋细 菌 Halobacillus sp. SCSIO 20089的适冷蛋白酶 HSPA2的组件结构， 结果显示自 N端的第 1-25位氨基酸为信号肽， 自 N端的第 75-125位氨基酸为 Thermolysin 蛋白酶前导肽的 Fimgalysin区序列， 自 N端第 136-221位氨基酸为蛋白酶前导肽 的 YPEB功能域， 自 N端的第 225-377位氨基酸为 Thermolysin金属蛋白酶的催 化域序列， 自 N端 379-528位氨基酸为 Thermolysin金属蛋白酶的 alpha螺旋区 序列。
6、 适冷蛋白酶基因 fepW的克隆和表达
使用上下游引物
hspai- Xhol: GCGC CTCGAG GGAAAAAGGAAC AGATGTCC AAAAG , hspai- Pstl: GCGC CTGCAG ATATACTCCTACATTATCCCAA,
以 Halobacillus sp. SCSIO 20089基因组 DNA为模板进行 PCR扩增适冷蛋白 酶基因 fe/ 3/4
， PCR反应程序为： 95 °C 5 95 °C 30 s, 55 °C 30s, 72 °C 1.5 min, 30个循环； 72 °C 10 min, 将 PCR产物进行琼脂糖电泳， 电泳图如图 1所示， PCR产物的大小与适冷蛋白酶基因 fepW的大小基本一致，割胶回收 PCR 产物，由此得到适冷蛋白酶基因 hspal PCR产物。用限制性内切酶 Pst I和 Xho I 酶切适冷蛋白酶基因 hspal PCR产物后， 与经 Pst I和 Xho I酶切的表达载体 PWB980 进行连接。 将连接产物转化至枯草芽孢杆菌 WB 600 中， 涂布到含 100μ§/ηι1氨苄青霉素和含质量分数 1%脱脂奶粉的 LB培养基平板上筛选阳性克 隆， 将能在含 10(^g/ml氨苄青霉素和含质量分数 1%脱脂奶粉的的 LB培养基上 生长的菌落进一步提取质粒 DNA， 然后再用内切酶 Pst I和 Xho I进行双酶切， 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 其电泳图如图 2所示， 由图 2可以看出， 双酶切 产物的大小与适冷蛋白酶基因 fepW的大小基本一致， 进一步测序分析表明， 序 列与适冷蛋白酶基因 hspal 的序列一致， 验证正确后命名重组质粒为 pWB9m-hspal。
将含有重组质粒 pWB980-fe/ 3/4
的 Bacillus subtilis WB 600点接种到含 1%脱 脂奶粉的 LB固体培养基平板上， 在 37 °C下培养 1天， 以转入空质粒 pWB980 的 WB 600作为对照。 其生长图如图 3所示， 由图 3表明， 含有 重组质粒 pWB980-fe/ 3/4
的 Bdcillus subtilis WB 600 (图 3的左图） 能够水解含 1%脱脂奶粉的 LB固体培养基中的牛奶中的蛋白成份，形成清晰的水解圈，而转 入空质粒 pWB980的 Bacillus subtilis WB 600 (图 3的右图） 则没有， 由此可见 适冷蛋白酶基因 hspal编码的适冷蛋白酶 HSPA2能够水解牛奶中的蛋白成份。
将含有重组质粒 pWB980-fe/^ 的 Bacillus subtilis WB 600单菌落接种至 5ml 含卡纳霉素的 LB培养基中， 37 °C振荡培养过夜。 以 2%的接种量将过夜培养物 转接至 superrich培养基中， 30°C， 200rpm振荡培养 40h。 9000转 /分钟离心 10 分钟， 上清即为含有适冷蛋白酶 HSPA2的粗酶液。
7、 适冷蛋白酶 HSPA2的酶活测定
粗酶液经离子交换层析与分子筛凝胶纯化后得到电泳适冷蛋白酶 HSPA2纯 酶液， 纯化过程参照 《蛋白质技术手册》， 纯酶液的电泳如图 4所示。 取 300μ1 稀释一定倍数的适冷蛋白酶 HSPA2纯酶液， 加入到 300μ1 2%的酪蛋白溶液中， 35 °C水浴 10分钟后，加入 600μ1 0.4mol/l三氯乙酸溶液，室温静置 20 min, 12000 r/min离心 10 min。取 ΙΟΟμΙ上清与 500 μ? 0.4 mol/1碳酸钠溶液混合后再加入 100 μ? Folin试剂， 40 °C水浴 20 min后测定在 660 nm的吸光值。 吸光值测定值与不 同含量的酪氨酸吸光度标准曲线图做比较计算酶活。 测得适冷蛋白酶 HSPA2的 酶比活为 3077 U/mg蛋白 （ 1U定义为在上述条件下每分钟转化生成 1 μ§酪氨酸 所需的酶量）。
8、 蛋白酶 HSPA2酶学性质的测定 参照步骤 7测定酶活的方法， 测定适冷蛋白酶 HSPA2纯酶液在 0?90°C (间 隔 5 °C ) 下的酶活， 以确定最适作用温度。 适冷蛋白酶 HSPA2的酶活随温度变 化如图 5所示， 从图 5可以看出， 本发明的适冷蛋白酶 HSPA2在低温条件下也 具有活性， 其最适作用温度为 35 °C。
参照步骤 7测定酶活的方法， 以不同 pH的缓冲液 （pH 3.0-6.5柠檬酸钠缓 冲液； pH 7.0-8.0磷酸缓冲液； pH 9.0-10.0 甘氨酸 -NaOH缓冲液）溶解的酪蛋 白为底物， 测定在不同 pH下的酶活， 以确定最适作用 pH。 适冷蛋白酶 HSPA2 的酶活随 pH变化如图 6所示， 从图 6可以看出， 本发明的适冷蛋白酶 HSPA2 的最适作用 pH为 8.0。
综上所述， 本发明的适冷蛋白酶 HSPA2是一种新的蛋白酶， 其编码基因一 适冷蛋白酶基因 hspal也是一种新的基因。
&110& 中国科学院南海海洋研究所
&120&—种海洋细菌适冷蛋白酶及其编码基因和应用
&211& 1590
&213& Halobacillus sp. SCSIO 20089
&222& ( 1 ) . ..(1590)
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