关于荧光定量PCR_exitgogo_天涯博客
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&荧光定量PCR起源：
荧光定量PCR（也称TaqMan&PCR,以下简称FQ-PCR）是美国PE（Perkin&
Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与变通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点。与普通PCR相比，FQ-PCR具有许多优点：1、封闭反应，无需PCR后处理。2、特异性强，灵敏度高。3、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。4、定量范围宽，可达到10个数量级。5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。6、可实现一管双检或多检。7、操作安全，缩短时间，提高效率。荧光定量&
PCR是&通过对&PCR&扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
荧光定量PCR分类：
☆TaqMan荧光探针
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5&-3&外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
☆SYBR&Green荧光染料
Green是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于任意反应体系中。从经济角度考虑，它也比其它的探针的价格要便宜得多。但由于它能与所有的双链DNA结合，所以一旦反应体系中出现非特异扩增，那它就会影响到定量结果的可靠性与重复性。要避免这种不利因素，可以通过选择良好的引物并优化反应条件以消除非特异性影响。
荧光定量PCR分类与原理：
聚合酶链式反应&(&PCR)&可对特定核苷酸片断进行指数级的扩增&
。在扩增反应结束之后，我们可以通过凝胶电泳的方法对扩增产物进行定性的分析，也可以通过放射性核素掺入标记后的光密度扫描来进行定量的分析&
。无论定性还是定量分析，分析的都是&PCR&终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经&PCR&
信号放大之前的起始模板量。例如我们想知道某一转基因动植物转基因的拷贝数或者某一特定基因在特定组织中的表达量。在这种需求下荧光定量&PCR&
技术应运而生。所谓的实时荧光定量&PCR&就是&通过对&PCR&扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量&
PCR&反应中，引入了一种荧光化学物质，随着&PCR&反应的进行，&PCR&
反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图&(&
如图&1)&。
1&实时荧光扩增曲线图&
&&&&一般而言，荧光扩增曲线扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信号阶段&,&
荧光信号指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。而在平台期，扩增产物已不再呈指数级的增加。&
PCR&的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的&PCR&产物量不能计算出起始&DNA&拷贝数。只有在荧光信号指数扩增阶段，&PCR&
产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，我们可以选择在这个阶段进行定量分析。为了定量和比较的方便，在实时荧光定量&PCR&
技术中引入了两个非常重要的概念：荧光阈值和&CT&
值。荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是&3-15&
个循环的荧光信号的标准偏差的&10&倍。每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为&CT&值（&threshold&value&）（如图&2&
图&2.&荧光定量标准曲线&
CT&值与起始模板的关系研究表明，每个模板的&CT&值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，&CT&
值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表&Ct&值（如图&3&所示）。因此，只要获得未知样品的&Ct&
值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。实时荧光定量&PCR&
的化学原理包括探针类和非探针类两种，探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的增加。前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但后者则简便易行。
SYBR&GREEN&I&工作原理&&
1．SYBR&Green&I&
图&4&SYBR&GREEN&I&工作原理&
SYBR&Green&I&是一种结合于小沟中的双链&DNA&结合染料。与双链&DNA&结合后，其荧光大大增强。这一性质使其用于扩增产物的检测非常理想。&SYBR&
Green&I&的最大吸收波长约为&497nm&，发射波长最大约为&520nm&。&在&PCR&反应体系中，加入过量&SYBR&荧光染料，&SYBR&
荧光染料特异性地掺入&DNA&双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的&SYBR&染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与&PCR&
产物的增加完全同步。&SYBR&Green&I&在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链&DNA&
相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。利用荧光染料可以指示双链&DNA&
熔点的性质，通过熔点曲线分析可以识别扩增产物和引物二聚体，因而可以、区分非特异扩增，进一步地还可以实现单色多重测定。此外，由于一个&PCR&
产物可以与多分子的染料结合，因此&SYBR&Green&I&的灵敏度很高。但是，由于&SYBR&Green&I&与所有的双链&DNA&
相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物的影响&1&
。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由&SYBR&Green&I&得到定量结果。&
2．分子信标（molecular&beacon）&
分子信标是一种在靶&DNA&
不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。在此发夹结构中，位于分子一端的荧光基团与分子另一端的淬灭基团紧紧靠近。在此结构中，荧光基团被激发后不是产生光子，而是将能量传递给淬灭剂，这一过程称为荧光谐振能量传递（&
FRET&）。由于&"&黑色&"&
淬灭剂的存在，由荧光基团产生的能量以红外而不是可见光形式释放出来。如果第二个荧光基团是淬灭剂，其释放能量的波长与荧光基团的性质有关。分子信标的茎环结构中，环一般为&
15-30&个核苷酸长，并与目标序列互补；茎一般&5-7&
个核苷酸长，并相互配对形成茎的结构。荧光基团连接在茎臂的一端，而淬灭剂则连接于另一端。分子信标必须非常仔细的设计，以致于在复性温度下，模板不存在时形成茎环结构，模板存在时则与模板配对。与模板配对后，分子信标的构象改变使得荧光基团与淬灭剂分开。当荧光基团被激发时，它发出自身波长的光子（图&
TaqMan&探针工作原理：
TaqMan&探针是多人拥有的专利技术。&TaqMan&
探针是一种寡核苷酸探针，它的荧光与目的序列的扩增相关。它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列配对。荧光基团连接在探针的&5&&末端，而淬灭剂则在&3&&
末端。当完整的探针与目标序列配对时，荧光基团发射的荧光因与&3&&端的淬灭剂接近而被淬灭。但在进行延伸反应时，聚合酶的&5&&
外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭剂分离。&TaqMan&探针适合于各种耐热的聚合酶，如&DyNAzymeTM&II&DNA&聚合酶（&MJ&
Research&公司有售）。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。&
图&6.&Taqman&探针工作原理&
4.&LUX&Primers&
LUX&(light&upon&extention)&引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项新技术。目标特异的引物对中的一个引物&3&&
端用荧光报告基团标记。在没有单链模板的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧光淬灭。在没有目标片断的时候，引物与模板配对，发夹结构打开，产生特异的荧光信号（如图&
图&7.LUX&引物工作原理&
与&Taqman&探针和分子信标相比，&LUX&引物通过二级结构实现淬灭，不需要荧光淬灭基团，也不需要设计特异的探针序列。因为&LUX&
引物是一个相对较新的技术，所以其应用还有待实践的检验。&
●主要实验步骤如下：&
RT-qPCR是由三个步骤组成:
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2.扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物.
具体实验操作步骤：
1.&&&&&&设计并合成Realtime&PCR引物。&
2.&引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG（SYBR&；&Green）的PCR反应的优化。&
3.&客户样品RNA抽提&
实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。&
实验对象为细胞样品，每份样品取1&106～1&107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA&
4.&RNA质量检测&&
a.&紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，以计算其浓度并评估RNA纯度&。
b.&使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。&
5.&使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。&
6.&制备标准曲线样品：&
进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。&
7.&标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime&PCR反应液中，进行RealTime&PCR扩增和检测。&
检测结果进行标准曲线分析：以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。&
9.&提供实验报告：包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果的相关图表&。
荧光定量PCR中的一些术语
1.&&&&&&CT值：荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数，或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。
2.&&&&&&阈值：阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
3.&&&&&&CT值与起始模板的量成线性关系。
主要仪器设备
Sigma&3-18K高速冷冻离心机&&&&&&&&&&德国Sigma公司
ABI&ABI&7500荧光定量PCR仪&&&&&&&&&美国ABI公司
ZKU-B120超低温冰箱&&&&&&&&&&&&&&&中国生命科技股份有限公司
Millipore&超纯水系统&&&&&&&&&&&&&&美国MILLIPORE公司
微量移液枪&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&Eppendorf公司
Bio-Rad核酸蛋白测定仪&&&&&&&&&&&&&美国Bio-Rad公司
主要试剂：
染料法用：CycleavePCR&&Core&Kit：
&&&&&&10&CycleavePCR&Buffer125&&l
&&&&&&dNTP&Mixture&(各2.5&mM)150&&l
&&&&&&Mg&Solution&(25&mM)250&&l
&&&&&&Ex&Taq&&HS&(5&U/&&l)12.5&&l
&&&&&&Tli&RNase&H&Ⅱ(200&U/&l)25&&l
&&&&&&Positive&Control&(104&copies/&l)*110&&l
&&&&&&Positive&Control&Primer&Mix&(各10&&M)10&&l
&&&&&&Positive&Control&Probe&(FAM标记)&*2&(25&)10&&l
&&&&&&dH2O700&
&&&&&&&&&&&&10&CycleavePCR&Buffer125&&l
&&&&&&&&&&&&dNTP&Mixture&(各2.5&mM)150&&l
&&&&&&&&&&&&Mg&Solution&(25&mM)250&&l
&&&&&&&&&&&&TaKaRa&Ex&Taq&&HS&(5&U/&&l)12.5&&l
&&&&&&&&&&&&Tli&RNase&H&Ⅱ(200&U/&l)25&&l
&&&&&&&&&&&&Positive&Control&(104&copies/&l)*110&&l
&&&&&&&&&&&&Positive&Control&Primer&Mix&(各10&&M)10&&l
&&&&&&&&&&&&Positive&Control&Probe&(FAM标记)&*2&(25&)10&&l
&&&&&&&&&&&&dH2O700&&l
&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&*1&Positive&Control是质粒，拷贝数由OD260简单换算得到，不是实际拷贝数。
&&&&&&&&&&&&*2&Positive&Control用探针，请避光保存。
&&&&&&&&&&&&EASY&Dilution&(for&Real&Time&PCR)&制作标准曲线时用于梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液
&&&&&&&&&&&&探针法用：CycleavePCR&&Core&Kit
&&&&&&&&&&&&&&&&&&10&CycleavePCR&Buffer125&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&dNTP&Mixture&(各2.5&mM)150&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&Mg&Solution&(25&mM)250&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&Ex&Taq&&HS&(5&U/&&l)12.5&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&Tli&RNase&H&Ⅱ(200&U/&l)25&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&Positive&Control&(104&copies/&l)*110&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&Positive&Control&Primer&Mix&(各10&&M)10&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&Positive&Control&Probe&(FAM标记)&*2&(25&)10&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&dH2O700&&l
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&*1&Positive&Control是质粒，拷贝数由OD260简单换算得到，不是实际拷贝数。
&&&&&&&&&&&&&&&&&&*2&Positive&Control用探针，请避光保存。
&&&&&&&&&&&&RNA抽提KIT
&&&&&&&&&&&&DEPC处理水
&&&&&&&&&&&&0.2mlPCR反应管
&&&&&&&&&&&&0.5/1.5/2.0ml离心管
&&&&&&&&&&&&1000ul/10ul/200ulTip
&&&&&&&&&&&&1000ul/10ul/200ulTip盒子
&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&
实时荧光定量&PCR技术的应用&
实时荧光定量&PCR&技术是&DNA&定量技术的一次飞跃。运用该项技术，我们可以对&DNA&、&RNA&
样品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度；后者可以对不同方式处理的两个样本中的基因表达水平进行比较。除此之外我们还可以对&
PCR&产物或样品进行定性分析：例如&利用熔解曲线分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩增；利用特异性探针进行基因型分析及&SNP&检测等。&目前&
实时荧光&PCR&技术已经被广泛应用于基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域。其中最主要的应用集中在以下几个方面：&
1.&DNA&或&RNA&的绝对定量分析&。包括&病原微生物或病毒含量的检测&,&转基因动植物转基因拷贝数的检测，&RNAi&基因失活率的检测等。&
2.&基因表达差异分析。例如比较&经过不同处理样本之间特定基因的表达差异&(&如药物处理、物理处理、化学处理等&)&，特定基因在不同时相的表达差异以及&cDNA&
芯片或差显结果的确证&
3.&基因分型。例如&SNP&检测，甲基化检测等。&
随着实时荧光定量&PCR&技术的推广和普及，该技术必然会得到更广泛的应用。
RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key&porint):
1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计
2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性
3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题
由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：
1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品
2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞
3.总RNA或者mRNA
4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略
5.不同的酶以及酶的不同组合
6.变异系数、灵敏度
7.多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA&质量评价
现在RNA&定量的程序很多。最近EMBO&qPCR&course&
(http://www-db.embl.de/jss/EmblGroupsOrg/conf_28)&比较了用Ribogreen,&Agilent&
BioAnalyser,&spectrophotometer,Nanodrop&and&the&BioRad&Experion&
来定量同样的样品。结果显示没有哪两种方法得到同样的分析数据。所以用不同的方法进行定量是不明智的。因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。传统的RNA质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。Agilent&
Bioanalyser/BioRad&Experion&
微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。Agilent的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S&
rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。样品的RINs在10-4之间。10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100％准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA的完整性。这里推荐一种方法：采用GAPDH的3&：5&分析法。
我们使用oligo&
dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。探针设计的位点分别位于3&;5&以及中部。扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。如果3&;5&的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
QRT-PCR&抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，heparin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系：
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA&.而且对于一些特殊的变异体以及较长的3&UTR的区域比较困难
3.特异引物：最特异最灵敏的方法。特别RNA量足够情况下建议使用此法。
PCR优化主要有：
1.引物的浓度
2.建议使用SYBR&Green&I和EvaGreen&进行扩增和溶解曲线的测试
实时定量PCR体系的优化&
1.基本参数的优化：&
1）MgCl2的浓度：在PCR反应中，MgCl2的浓度对酶的活性是至关重要的，不仅如此，合适的MgCl2的浓度还能在反应中得到较低的Cp(crossingpoint)值（指PCR达到指数扩增期时，产生一定的荧光高于背景并为仪器所识别时的循环数），较高的荧光信号强度以及良好的曲线峰值。所以对其的浓度选择应慎重。一般来说，对以DNA或cDNA为模板的PCR反应，应选择2－5mM浓度的MgCl2，对以mRNA为模板的RT－PCR而言，则应选择的浓度为4－8mM。&
2）模板的浓度：如果研究者是进行首次实验，那么应选择一系列稀释浓度的模板来进行实验，以选择出最为合适的模板浓度，如果条件困难，也至少要选择两个稀释度（高和中、低浓度）来进行实验。一般而言，使Cp位于15－30个循环比较合适，若大于30则应使用较高的模板浓度，如果Cp小于15则应选择较低的模板深度。对于Cp值的确定，经验上是SYBRGreenI探针的荧光信号比本底高2倍，杂交探针的荧光强度比本底高0.3倍。&
2.使用SYBRGreenI测定DNA时的条件优化：&
1）MgCl2的浓度：大多数引物－模板对其的要求是2－4mM。&
2）模板的浓度：初次实验要求做一系列的稀释浓度，如条件限制，至少完成两个稀释的度的测定。DNA在50ng-5pg之间选择，质粒DNA在106拷贝数左右。&
3）引物的浓度：引物的浓度是一个影响PCR反应的关键因素，若浓度太低，会致使反应不完全，若引物太多，则发生错配以及产生非特异的产物的可能性会大大增加。对于大多数PCR反应，0.3uM是个合适的浓度，若初次选用这个浓度不理想，可在0.1－1.0uM之间进行选择，直至达到满意的结果。&
4）退火温度：首次实验设置的退火温度应比计算得出的Tm值小5℃，然后在1－2℃内进行选择。一般的，退火温度要根据经验来确定，这个经验值往往会同计算得到的Tm值有一定的差
4.&&&&&&&&用SYBRGreenI进行一步法RT－PCR的条件优化：&
1）MgCl2的浓度：不同的靶分子选用不同的浓度，通常是在4－8mM之间选择。&
2）模板的浓度：RT－PCR实验既可以选用总RNA，又可以选用mRNA，其浓度应在1pg-1ug之间选择。对于低模板浓度，可以增加适量的MS2或用alternativeRNA作为载体进行测定。&
3）对照设置：每一引物都应设有阴性对照，阳性对照和污染对照。&
4.杂交探针测定DNA&
1）MgCl2的浓度：在2－4mM的基础上加0.5－1.0mM，但是不要超过2.0mM。&
2）杂交探针的浓度：初次实验每个探针用0.2uM，如果信号强度达不到要求，可以增加至0.4uM。&
3）对照设置：每一引物都要设阴性对照，每一探针都要设阴性对照。每次实验都要设阳性对照。&
4）其它的条件同SYBRGreenI。&
5.用杂交探针进行实时定量RT－PCR：&
1）MgCl2的浓度：在4－8mM之间进行选择。&
2）杂交探针的浓度：初实验用0.2uM，如果荧光信号强度不足，可以增加至0.4uM。&
3）模板浓度设置：优化的扩增须进行一系列稀释度的实验，在条件有困难的情况下，至少要进行两个稀释度的测定。选用1pg-1ug的总RNA或是mRNA，若是模板的浓度过小（小于10ng/ul），则可加入MS2或alternativeRNA作为载体。&
4）对照设置：每个引物都要设无模板对照，阳性对照以及污染对照。&
6.关于杂交探针的评价：在使用杂交探针进行实验时，必须注意防止探针－引物二聚体的形成和其本身在反应过程中的延伸。引物－探针二聚体的形成，主要是因为探针可与引物的3&末端杂交，其形成以后，会致使此二聚体扩增，从而同目的基因竞争反应的原料，导致反应的效率下降。探针其本身能同目的基因相结合，且其解链温度高于引物，所以它可能作为引物而引发延伸反应，为了防止发生这种现象，通常是将其3&末端完全磷酸化，使之不能延伸，若此磷酸化不完全或是没有磷酸化，就会产生目的基因的副产品，从而干扰实验结果。鉴于以上这两点，所以应对探针精心设计，并将其末端完全磷酸化。
引物和探针的设计：
DNA引物长度:15-25&个碱基
GC含量:50%左右
如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3&端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争,分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:&10&
kcal/mol.没有连续的G/C.
引物设计原则：
1.上下游引物要保守为了能够扩增出所需要的保守片段，必须对保守的100-200片段进行PCR扩增。所以引物的选取也要非常的保守。
2.上下游引物的长度一般为18-30bp之间，且Tm值在58-62℃之间，上下游引物的Tm值相差最好不超过2℃。
3.确保引物中GC含量在30-80%。应避免引物中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基出现。引物的3&端最好不为G或/和C。引物3&端的5个碱基不应出现2个G或/和C。
4.避免引物内出现反向重复序列形成发夹二级结构，同时也应避免引物间配对形成引物二聚体。5．跨外显子设计引物，用于区别或消除DNA的扩增。
探针设计基本原则：
1.&保守：探针要绝对的保守，有时分型就仅仅依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。
Taqman探针的长度最好在25-32bp之间，且Tm值在68-72℃之间，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出5-10℃，这样可保证探针在退火时先于引物与目的片段结合。
3.&确保探针中GC含量在30-80%。
4.&避免探针中多个重复的碱基出现，尤其是要避免4个或超过4个的G碱基
5.&探针的5&端不能为G，因为即使单个G碱基与FAM荧光报告基团相连时，&也可以淬灭FAM基团所发出的荧光信号，从而导致假阴性的出现。
6.&Taqman探针应靠近上游引物，即Taqman探针应靠近与其在同一条链上的&上游引物。两者的距离最好是探针的5&端离上游引物的3&有一个碱基。
7.&避免探针与引物之间形成二级结构。
8.&对于多重定量PCR，例如SNP分型检测时，SNP位点应设计在探针的中间位置，并且两种探针的Tm值应相近。
相关设计网站：
1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件.
RTPrimerDB&(http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),
PrimerBank&(http://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html)
Real&Time&PCR&Primer&Sets&(http://www.realtimeprimers.org)
如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:
A.最广泛使用的商业化的软件Beacon&Designer()
B.DIY的软件Primer&Express
C.如果Beacon&Designer&无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys&
)的服务方案,详细周到
D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序:&/products/probe_design.asp
您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR
如何进行定量：
定量PCR除可以对样品的初始浓度进行准确定量外，还有其它多种丰富的应用。还包括基因表达调控情况的分析、等位基因的分析等，那么这些功能是如何在一台定量PCR仪上实现的呢？下面将进行一一介绍。
利用标准曲线对样品的初始浓度进行定量：&
用已知浓度的标准品绘制标准曲线来对未知样品定量，首先要有一组稳定的标准品。标准品可以是含有目的基因的线性化的质粒DNA，也可以是比扩增片段长的纯化后的PCR产物，当然也可以是DNA，甚至cDNA，但前提是所有的作为标准品的核酸都必需保证稳定。一般一条标准曲线取四到五个点，浓度范围要能覆盖样品的浓度区间，以保证定量的准确性。一般一个点重复三至五次，对于常期稳定使用的标准品可以适当减少重复的次数。&
以Rotor-Gene3000的操作为例，以标准曲线对未知样品定量是默认的分析方法。软件可在反应尚在进行时就对结果进行分析，结果随着反应的进行可实时更新，当然也可以等反应完全结束后再进行分析。
点示&Analysis&，弹出分析框，默认分析功能即为&Quantitation&，点击&Show&，软件即自动给出包括标准曲线（包括R值，R平方值，扩增效率、标准曲线公式等）、标准化的荧光曲线、各样品计算浓度（包括标准偏差、变异系数等）在内的结果。
若是使用SYBR&Green&I法，还可进行熔解曲线分析，以判断退火温度是否合适，产物中是否有引物二聚体的影响。对于SYBR&Green&
I的客户，我们建议一定要在最后做一步熔解曲线的分析，这对于反应条件的优化和结果的正确判定都有着非常重要的作用。
同样，点击&Analysis&，在分析窗口中选择&Melt&，点击&Show&，自动给出分析结果。
完成了所需的分析之后，如还需给出分析结果报告，点击&Analysis&边上的&Report&选项，选择报告模板，软件自动给出报告。
利用定量技术进行基因型分析研究：&
常用的分析方法有两种，一种是Taqman探针法，一种为FRET探针法（又称Hyb探针），运用以上两种方法进行基因型的分析需要一台有多通道的荧光定量PCR仪。Taqman探针分析基因型是以扩增信号的有无来判定，而FRET探针则根据扩增后片段熔解温度的不同来判定。&
以下为用Taqman探针判断基因型的实例：这里，突变型的探针以FAM荧光素标记，野生型的探针以VIC荧光素标记，检测时分别同时检测了FAM通道和VIC通道的荧光情况。这里，3、4号样品只在FAM通道有信号，而在VIC通道里无信号，表明这两个样品为突变型；1、2号样品在FAM通道无信号，在VIC通道有信号，表明这两个样品为野生型；而5、6号样品在两个通道都有信号，但荧光强度恰为其它样品的一半，说明这两个样品为杂合型。并且，我们可以在软件里将不同的通道定义为不同的基因型，软件会根据不同样品在各个通道的荧光情况，自动对各个样品的基因型做出判定。
利用相对定量的方法分析目的基因的上下调情况：
基因表达调控研究中，常用的相对定量方法主要有两种，Delta-deltaCt法和双标准曲线法。由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。我们分别来看看以上两种相对定量分析方法的特点和应用。&
Delta-deltaCt：&
由Delta-delta&Ct的公式可以看出，该方法直接利用看家基因来校正样品初始量，但同时默认两个基因扩增效率一致。
Comparative&Delta-delta&Ct法的特点、注意事项及实际应用：
1.&Comparative&Delta-delta&
Ct法的一大特点是，当优化的体系已经建立后，在每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。
2.&每次实验都默认目的基因和看家基因的扩增效率一致，而并非真实扩增情况的反映，因此实验条件需要严格优化，并且总会存一定的偏差。
用Comparative&Delta-delta&Ct法展开定量实验前，在预实验中，必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。Rotor-Gene&
的软件会自动给出两组标准曲线的R值、扩增效率等信息，如果两组标准曲线的斜率，即M值的差小于0.1，表明两个基因的扩增效率已非常接近，那么后续实验中就可以用Comparative&
Delta-delta&
Ct法进行相对定量分析。反之，如果M差值大于0.1，就无法用该方法进行相对定量分析。此时的解决方法有两种，一是优化实验，使两组标准曲线的斜率差值小于0.1，二是换用其它的相对定量方法。
下面是某科研用户用Delta-delta&Ct进行相对定量分析的实例：
首先，该客户分别做了目的基因和看家基因的确标准曲线，根据软件自动给出的M值判断该方法的可行性：
如下图，将标准品进行梯度稀释后，分别对目的基因（Gene&of&Interest）和看家基因（Housekeeper&
Gene）做标准曲线。软件自动绘制标准曲线，并给出相应的参数。从上图可知，两组标准曲线的M值分别为-3.525和-3.467，两者的差值&0.1，因此，这组看家基因和目的基因可以用Comparative&
Delta-delta&Ct法进行相对定量。确定这两个基因可以用Delta-delta&
Ct法分析后，用户扩增了其待测样品的目的基因和看家基因。经软件自动分析后，给出分析结果，如下：我们看到，在该客户的实验中，以样品A为对照组，软件自动组出了样品B和C的目的基因相对于样品A的表达情况。&
这种方法对于样品量大，但研究的基因数目相对较少的客户特别有用，因为一旦条件优化好之后就无需再做标准曲线，节约了试剂和样品量，实验操作也相对简单。
双标准曲线法：
双标准曲线法考虑到了不同基因扩增效率的差异，用标准曲线来校正扩增效率。
双标准曲线法的特点、注意事项及实际应用：
1.&双标准曲线法做相对定量分析的最大特点是，应用简便，无需像Delta-delta&CT法那样对实验进行严格的优化。
2.&其不足之处是每次实验都必需对目的基因和看家基因做两组标准曲线。
并且，如果用于做标准曲线的标准品不同于样品，比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况，因此以标准曲线来计算样品的实际浓度就存在一定误差。每种相对定量方法都会有一定的局限性，对于双标准曲线法，比较适合于样本量不大，但研究的基因较多的客户，这样对不同基因条件优化相对Delta-delta&
Ct法更为简单。下面是某科研用户用双标准曲线法进行相对定量分析的实例。要用该方法进行分析，客户在一轮反应中，对目的基因和看家基因分别做了一组标准曲线，同时也分别扩增的待测样品的目的基因和看家基因。如下图，选择软件中相应的分析方法。
软件自动给出分析结果：
同样，结果自动给出了待测样品相对于对照组目的基因的表达情况。
比较定量法：&另一种相对定量分析方法叫比较定量法(ComparativeQuantitation)，该方法在结果验证中的应用相对较多。&
比较定量法的特点、注意事项及实际应用：&
1．必需确定起始样品的总核酸浓度一致。在验证时使用较多，但同样也必需有起始浓度一致的核酸样品。2．作为常规的基因表达调控研究，建议研究者使用前两种定量方法。&
3．该方法通过拐点时的循环数来进行相对定量比较，重复性更好。&
4．该方法操作非常简便，无需做标准曲线及设置内参。使用时，样品均定义为unknown，分析时选用ComparativeQuantitation，确定对照组，完成分析。&}