什么样的lncRNA能登顶Science – GCBI学院
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什么样的lncRNA能登顶Science – GCBI学院
（Long non-coding RNA，LncRNA）是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。LncRNA一直是研究的热点，其作用机制多元，并不像那样具有固定的模式，这也是研究的难点之一。那如何去开展LncRNA研究呢？在转录组研究中，研究思路不外乎高通量测序，，选择感兴趣的基因进行。在上篇推文中，作者实验加生信分析，做到功能预测这一步，就发了4.5分SCI，那如何发高一点，再高一点的SCI呢？今天就一起来看看Science上的lncRNA研究是如何做的。
研究领域：免疫 & & & & & & & & & 相关基因: ，
杂志：Science && & & & & & & &&& &IF: 34.661
& & & & & &样本：，
这篇文章主要探究lncRNA在树突细胞（，DC）分化及功能中的作用。作者发现了一个关键的lncRNA(lnc-DC)，并用实验验证了其功能和作用机制，思路图如下：
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &图1 &文章思路图（mono指单核细胞monocytes，DC指树突细胞Dendritic cells；DC由mono分化而来的）
那为啥就能发Science呢？
作者研究的是lncRNA在DC细胞分化和功能中的作用，在当时14年很少有lncRNA在免疫方面的研究。且2011诺贝尔生理学/医学奖授予的就是树突细胞研究者。树突细胞能递呈抗原，激发T细胞应答，可通过大量体外活化培养负载肿瘤抗原的树突细胞回输给病人，诱导机体产生强烈的抗肿瘤免疫反应，所以DC在肿瘤的免疫治疗中具有巨大的应用前景。
?作者发现了lncRNA在细胞质中一种新的作用机制，其直接结合信号分子来调节翻译后修饰，在当时拓宽了对lncRNA作用机制的认识。
最后还需要系统严谨的实验作为支撑。作者从最初lncRNA的筛选，验证，到目标lncRNA自身特性，表达和功能机制的研究，可以说在lncRNA的研究上已经很深入，也很系统。实验一环扣一环，正反证，反正证，真正是用实验结果堆出来的文章。
下面具体看下作者是如何一步步做lncRNA的研究的。
1 &筛选lncRNA
作者首先用芯片HTA 2.0 transcriptome microarray assay检测了mono分化至DC过程中(7天)lncRNA的表达变化，在124个显著变化的lncRNA中（fold change&16，p&0.05），有24个被诱导。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &图2 &DC分化过程中lncRNA热图
为确保结果的准确性和可靠性，作者又用二代测序Illumina HiSeq 2000&检测了0点和第7天的lncRNA表达情况，99个lncRNA差异显著(fold&4,FDR&0.05)。对两个结果取交集，筛选了表达倍数高的lnc-DC作为下一步的研究对象。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &图3 &二代测序lncRNA表达情况（红色为显著差异lncRNA）
2 &验证lnc-DC
为确保结果的准确性，进一步用Northern blot对lncDC的表达进行了验证，确证lnc-DC在DC分化过程中的高表达。在验证这一步，还可以选择qPCR，两者各有优缺点，可以自行选择合适的方法。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 图4 lnc-DC的Northern blot验证结果3 &Lnc-DC自身特性研究
可对目标lncRNA进行基因组定位，序列保守性，全长及结构等方面进行研究。
基因组定位
可用Genome browser对lnc-DC进行基因组定位，并查看其临近基因。调控邻近基因表达是lncRNA的一种作用机制。& &&
序列保守性估计
可用PhastCons进行序列保守性估计。& & &
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 图5 &lnc-DC和邻近基因HEATR6序列的保守性估计
转录起始位点、结束位点及全长验证
可用RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &图6 RACE进行转录起始位点和结束位点及全长验证结果
可用RT-PCR进行5‘端和3’端结构探究，发现lnc-DC有poly A尾和5‘端帽子。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &图7 RT-PCR验证lncDC结果
编码能力验证
将lnc-DC转入HEK293T细胞进行表达验证，其无编码能力，同时用生信方法对其序列进行编码能力预测，与实验结果一致。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &图8 lnc-DC编码能力验证结果（左，片段构建；右，免疫印迹结果）
4 &表达研究
表达特异性作者选取其他免疫细胞进行比对，分别通过实验及数据库中的数据分析，发现lnc-DC只在cDC（conventional DC）中特异性表达。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 图9 lnc-DC在不同细胞中表达结果
表达机制研究
组蛋白修饰可调控基因表达，作者采用CHIP-seq和CHIP-qPCR进行组蛋白修饰研究，并通过DNAase I 的敏感性来衡量染色质的疏松状态。在lnc-DC位点组蛋白H3K4me3和H3K27ac修饰，染色质较为疏松的状态及转录因子PU.1促进了lnc-DC在cDC中的特殊表达。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 图10 lnc-DC表达机制研究结果
?5 &Lnc-DC功能研究
作者通过RNAi敲除及过表达lnc-DC来研究其功能，敲除和过表达结果相反。敲除lnc-DC后，作者分别从基因、蛋白的表达及功能的影响来考察lnc-DC的功能。最后表明lnc-DC促进了DC的分化，对DC抗原的递呈及增加T细胞增殖上具有重要作用，同时小鼠体内外实验也有相同结论。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &图11 lnc-DC RNAi基因表达结果
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 图12 lnc-DC RNAi蛋白表达结果
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & 图13 lnc-DC RNAi后DC抗原递呈能力（左）及激活T细胞增殖情况（右）
在机理研究中，可用排除法，先考察是否和目前已经报道的作用机制一致。LncRNA的作用机制中，其中有cis顺式调控和trans反式调控。Cis顺式调控影响邻近基因的表达，在之前的实验环节，发现lnc-DC敲除对邻近基因表达没有影响。接下来作者用FISH对lnc-DC进行细胞定位，显示lnc-DC处于细胞质中。LncRNA在细胞质中有两种作用方式，可作为ceRNA与miRNA结合恢复mRNA的翻译，或与ALU元件作用促进STAU1介导的mRNA衰退。RNA免疫沉淀 （RIP）表明lnc-DC不与AGO2作用，排除了lnc-DC和miRNA的作用机制。用生信分析表明lnc-DC没有与ALU的作用序列，所以lnc-DC有新的作用机制。作者用pull-down（蛋白质体外结合实验）联合MS发现lnc-DC与STAT3（转录因子）相互作用，并用系列实验找出了lnc-DC和STAT3的作用位点及调节方式，详细过程请参见文献。下图是作者推测的lnc-DC的作用机制模拟图。
& & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & & &图14 DC分化过程中lnc-DC的作用机制模型在mono分化至DC的过程中，组蛋白H3K4me3和H3K27ac的增加伴随着染色质的疏松，促进转录因子PU.1的结合，增强了lnc-DC的表达。lnc-DC转录后即转运至细胞质，与STAT3结合，阻止了SHP1对STAT3的去磷酸化，增强了STAT3的信号通路，最终促进了DC细胞的分化。
在这简单梳理了作者的研究思路，从lncRNA的筛选，验证到功能机理研究，详细可参见文献。
这篇文章对我们有什么启发呢？
首先立意一定要新，想想有什么热点是可以与自己的研究方向结合的。其次是严谨的思路和系统的实验，这些是完全可以参照和套用的。14年lncRNA研究的science的标准在这，请大家用心体会……
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&&LncRNA芯片及LncPath(TM) 芯片技术服务
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成立时间：1997年
入驻丁香通年限：4年
商家等级：金牌客户
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一、LncRNA芯片技术服务
长链非编码RNA (LncRNA) 是一类长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。近年来的研究表明：LncRNA广泛参与各种生物学过程，LncRNA的异常表达与包括癌症在内的多种疾病密切相关。通过LncRNA芯片，研究人员能够快速高通量的获得与特定生物学过程或者疾病相关的LncRNA的表达变化，从而为后续的LncRNA功能研究或生物标志物筛选提供极大的便利。
Arraystar LncRNA芯片可同时检测LncRNA和mRNA，这一突破性芯片平台的构建，使Arraystar成为LncRNA研究领域的先驱和领导者。迄今为止，采用Arraystar LncRNA芯片已发表的SCI论文已超180篇，其中多篇发表在Cancer Cell，Mol Cell，Hepatology，Blood，EMBO等国际顶尖杂志上。
康成生物是Arraystar中国区唯一代理商，独家为您提供Arraystar公司长链非编码RNA芯片全程一站式技术服务。您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成的芯片技术服务人员就可为您完成全部实验操作，并提供完整的实验报告。同时，根据您的研究需要，康成还提供各种深入数据挖掘服务。
Arraystar公司LncRNA芯片产品列表
Human LncRNA
Microarray Service
NEW Human LncRNA Array V4.0
color="#x60K
LncRNAs (40173) + coding genes (20730)
Mouse LncRNA
Microarray Service
NEW Mouse LncRNA Array V3.0
color="#×60K
LncRNAs (35923) + coding genes (24881)
Rat LncRNA
Microarray Service
Rat LncRNA Array V2.0
color="#×44K
LncRNAs (13611) + coding genes (24626)
Arraystar LncRNA Array芯片特点o 检测lncRNA表达量灵敏度高、技术最成熟：lncRNA表达水平比mRNA低，芯片比RNA-seq更适合对低丰度RNA分子的检测。o 收录lncRNA更新最及时，覆盖最全面、最可靠：可同时检测lncRNA和编码蛋白的mRNA。o 系统而实用的lncRNA注释：注释LncRNA基因组信息、分类及潜在的调控机制，为深入研究lncRNA复杂生物学功能提供参考信息。o 转录本特异型的探针设计：Arraystar lncRNA芯片采用转录本特异性的探针设计，对不同转录本检测更准确、特异性更高。o 提供丰富的数据信息：用于调控型lncRNA与编码蛋白的mRNA之间共表达及关联研究。 康成生物LncRNA芯片技术服务实验流程1. 样品总RNA抽提
若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
若实验对象为细胞样品，每份样品取1×106~1×107细胞，完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。2. RNA质量检测
使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性3. cDNA样品合成和标记4. 标记效率质量检测
使用Nanodrop检测荧光标记效率，以保证后续芯片实验结果的可靠性。5. 芯片杂交
在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。6. 图像采集和数据分析
使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。7. 提供实验报告
芯片扫描图
实验方法中英文报告
RNA质检报告
芯片数据结果报告，包括差异表达LncRNA列表，差异表达基因列表
常规lncRNA芯片研究流程 康成客户实例——Arraystar LncRNA表达谱芯片Repression of the long noncoding RNA-LET by histone deacetylase 3 contributes to hypoxia-mediated metastasis. Molecular Cell. 2013.使用芯片： Arraystar Human LncRNA Microarray
研究者通过 Arraystar Human LncRNA芯片筛查到了在肝细胞癌中特异性低表达的LncRNA分子（LncRNA-LET），并在大规模临床样本中利用实时定量PCR实验发现该LncRNA分子在肝细胞癌、结肠癌和鳞状细胞肺癌中都有特异性低表达；进一步的研究表明该LncRNA的显著下调由缺氧性组蛋白脱乙酰化酶3介导，并通过调节NF90蛋白影响癌细胞转移。本研究首次在分子机制的角度阐述了缺氧、组蛋白乙酰化、LncRNA分子和癌细胞转移之间的关系，找到了新的影响癌细胞转移的治疗靶点，有着重大的生物和临床意义。HBx-related lncRNA Dreh inhibits hepatocellular carcinoma metastasis by targeting the intermediate filament protein vimentin. Hepatology. 2012.使用芯片：Arraystar Mouse LncRNA Microarray
研究人员利用Arraystar Mouse LncRNA芯片在HBx转基因小鼠肝脏中筛选出差异表达的LncRNA，其中LncRNA.Dreh (AK050349)表达量在所有年龄和性别的转基因小鼠中都显著下调。对LncRNA.Dreh进行深入研究发现，LncRNA.Dreh能结合中间丝蛋白并抑制其表达，通过改变细胞骨架结构和形态，抑制癌细胞的增殖和转移。对50例临床样本(肝癌组织v.s.癌旁组织)的研究发现：该分子在癌组织中表达量比正常组织低，并且和病人的预后相关，LncRNA.Dreh表达量高的病人复发率低并且生存期长。该研究首次将乙肝病毒自身表达的HBx蛋白和肝脏组织中的LncRNA关联起来，找到了新的肝癌预后标志物，有着重大的临床意义。Long non-coding RNA high expressed in hepatocellular carcinoma (LncRNA-HEIH) facilitates tumor growth through enhancer of zeste homolog 2. Hepatology. 2011使用芯片： Arraystar Human LncRNA Microarray
研究者首先通过LncRNA芯片实验和RT-PCR验证，在5例肝癌组织与5例癌旁组织样本中找到了一个肝癌细胞高表达的LncRNA（LncRNA-HEIH），并且在大量样本（50例肝癌和正常组织，20例肝硬化组织和正常肝组织）验证了LncRNA-HEIH的特异性。通过基因共表达网络图和病人生存时间等临床数据关联分析，发现LncRNA-HEIH可以作为一个独立的判断HCC病人生存时间的预后指标。一般LncRNA-HEIH表达越高，HCC病人的预后越差。然后研究人员对LncRNA-HEIH的功能展开了深入的研究。首先利用过表达技术（gain of function ）和RNAi技术（loss of fuction）发现LncRNA-HEIH能促进细胞增殖，在细胞周期调控过程中起重要作用。RNA免疫共沉淀和ChIP等实验揭示了LncRNA-HEIH可以通过结合EZH2招募PRC2，进而抑制下游靶基因的表达，实现调控细胞周期的功能。这些结果提示在肝细胞癌症发生过程中，LncRNA-HEIH可能是一个重要的调控“枢纽”。上图：肝癌（n=5）和癌旁组织（n=5）的芯片聚类结果。Arraystar公司的lncRNA芯片同时设计了mRNA与lncRNA，图A为差异表达的254个mRNA聚类结果，图B为差异表达的174个lncRNA聚类结果。红色代表上调，绿色代表下调。二、LncPathTM 芯片技术服务
长链非编码RNA (LncRNA) 是一类转录本长度超过200nt的RNA，它们本身并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。近年来的研究表明：LncRNA广泛参与各种信号通路，LncRNA的异常表达与包括癌症在内的多种疾病密切相关。迄今为止，研究得比较透彻的LncRNA还很少，超过99%的LncRNA的功能和调控机制尚不清楚。为了促进LncRNA的研究，Arraystar公司开发了LncPathTM 疾病/信号通路特异性LncRNA芯片。LncPathTM 芯片可以同时检测与特定疾病或信号通路相关的LncRNA以及相应的靶基因，帮助客户快速的将LncRNA的调控机制与其在特定的信号通路或疾病中的生物学功能联系起来。
康成生物是Arraystar公司中国地区唯一代理商，为您提供一站式LncPathTM 芯片技术服务，您只需要提供保存完好的组织或细胞标本，康成的芯片技术服务人员就可为您完成全部实验操作，并提供完整的实验报告。
LncPathTM 疾病/信号通路特异性LncRNA芯片产品列表 LncPathTM疾病/信号通路特异性LncRNA芯片特色 o
对疾病/信号通路特异性LncRNA可靠的收集o
快速的建立LncRNA调控机制与其生物学功能之间的联系o
图形化的展示LncRNA及其靶基因的信息o
创新性的探针设计o
高效、稳定的标记系统o
可靠的芯片性能o
聚焦于与疾病或信号通路相关的少量LncRNA和mRNA，使得数据分析流程更加快速，精准。对疾病/信号通路特异性LncRNA可靠的收集
LncPathTM芯片通过整合权威数据库，经典文献和Arraystar LncRNA数据库等资源，对疾病/信号通路特异性的LncRNA进行了全面，可靠的收集，涵盖的LncRNA主要有：1）疾病/信号通路特异性蛋白编码基因的邻近LncRNAs； 2） 疾病/信号通路特异性蛋白编码基因的长链非编码ceRNAs； 3） 已知的与特定疾病或信号通路相关的LncRNAs。图1. LncPathTM芯片的LncRNA收集流程。 快速的建立LncRNA调控机制与其生物学功能之间的联系
LncPathTM芯片可以同时检测与特定疾病或信号通路相关的LncRNA以及相应的靶基因，并且对LncRNA和靶基因的关系进行了详细的注释，能够帮助客户快速的将LncRNA的调控机制与其在特定的信号通路或疾病中的生物学功能联系起来。图2. 通过LncPathTM芯片建立LncRNA的调控机制与其生物学功能之间的联系。 图形化的展示LncRNA及其靶基因的信息
LncPathTM芯片提供LncRNA及其靶基因信息的图形化展示，通过图形化展示客户可以迅速了解LncRNA及其靶基因的关系（图3），方便后续的机制和功能研究，这些图形化展示结果都可以通过Arraystar网站免费获得。图3. 可能调控WNT信号通路中的关键基因CCND2的LncRNAs详细信息。 创新性的探针设计
LncPathTM芯片采用了创新性的探针设计：针对每个LncRNA设计转录本特异的LncRNA探针，保证对LncRNA的准确检测。针对每个蛋白编码基因设计两种探针：基因探针和转录本特异性探针。基因探针用于检测基因水平的表达情况，它的信号可以用来表征邻近LncRNA或其它LncRNA通过转录调控机制对此蛋白编码基因的影响。转录本特异性探针用于检测此基因的经典转录本的表达，它的信号可以用来表征长链非编码ceRNA或其它LncRNA通过转录后调控机制对此蛋白编码基因的影响（图4）。图4. LncRNA探针：转录本特异性探针，可以准确的检测LncRNA；
基因探针：用于检测蛋白编码基因在基因水平的表达情况。它的信号可以用来表征邻近LncRNA或其它LncRNA通过转录调控机制对此蛋白编码基因的影响。
转录本特异性探针：用于检测蛋白编码基因在转录本水平的表达情况。它的信号可以用来表征长链非编码ceRNA或其它LncRNA通过转录后调控机制对此蛋白编码基因的影响。 高效、稳定的标记系统
LncPathTM芯片采用了一种高效，灵活的标记系统（图5）。这种标记方法不但可以同时标记带PolyA尾巴和不带PolyA尾巴的转录本，还可以极大的增加低丰度RNA和降解RNA的cRNA产率，灵敏度比常规标记方法高100倍以上。图5. 高效，灵活的标记系统。 可靠的芯片性能高灵敏度：能准确检测跨域5个数量级的低丰度RNA （图6） 图6. LncPathTM芯片具有跨越超过5个数量级的检测范围。横轴代表Spike-in浓度的log值，纵轴表示Spike-in芯片信号（log2转化后）。高重复性：Arraystar circRNA 芯片实验的技术重复组之间具有很好的相关性（R2&0.9）（图7）图7. LncPathTM芯片技术重复间的散点图。分别用同样的样品在不同两天进行芯片标记和杂交反应，并根据芯片信号做出散点图，从图中可以看出：芯片间的相关性非常高（R2&0.9），说明LncPathTM芯片平台重复性很好，非常稳定。 LncPathTM疾病/信号通路特异性LncRNA芯片应用思路
康成生物疾病/信号通路特异性LncRNA芯片技术服务流程1. 样品总RNA抽提
若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
若实验对象为细胞样品，每份样品取1×106~1×107细胞，完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。2. RNA质量检测
使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性3. 加入Spike-in内参4. cDNA样品合成和标记5. 标记效率质量检测
使用Nanodrop检测荧光标记效率，以保证后续芯片实验结果的可靠性。6. 芯片杂交
在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。7. 图像采集和数据分析
使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。8. 提供实验报告
芯片扫描图
实验方法中英文报告
RNA质检报告芯片数据结果报告，包括差异表达LncRNA列表，差异表达基因列表，差异LncRNA与相应靶基因的详细注释
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——日读一帖，解螺旋大V团队伴你科研路【科研热点】让你时间比别人花的少、知道的比他早！【基金专栏】国自然等各项基金独到经验见解【SCI 专栏】从开始到接收全程tips【实验技能】这么棒快告诉你老板！　关注我们，为您的科研路提速　　lncRNA 的研究已经在世界范围内变得越爱越热门，通过这些年的研究，lncRNA的机制研究也形成了一定的套路：　　1）高通量分析lncRNA的表达；　　2）验证高通量筛选后的结果；　　3）研究lncRNA与蛋白之间的相互作用。　　接下来的文章中，老谈会和大家一起讨论lncRNA机制研究中常用的方法，欢迎小伙伴们积极参与讨论。（一）高通量分析lncRNA 的表达　　随着lncRNA研究的不断深入，现在已经有了很多很成熟的lncRNA芯片产品，可供选择。另外二代测序的兴起，也使得RNA-seq成为分析lncRNA表达谱的有效手段。当然从费用的角度讲，lncRNA 的芯片更便宜，二代测序RNA-seq的成本更高。不过土豪请随意！　　应用lncRNA芯片或者RNA-seq进行lncRNA表达谱分析的研究已经有了很多。例如，Orom等人在人类的细胞系中通过lncRNA的芯片筛选，鉴定了3019条lncRNA的表达分布。另外，Ng等通过定制化的lncRNA芯片（customized microarray）研究了人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，hESCs）内的lncRNA表达谱（expression profile）。他们发现有一些胚胎干细胞特异性的lncRNA对于维持干细胞的多能性（pluripotency）有非常重要的作用。在肿瘤研究（乳腺癌、胰腺癌、肝癌等）中，lncRNA芯片的应用也是非常地广泛。　　相对于lncRNA芯片在表达谱研究方面的广泛应用，RNA-seq方法的应用领域则明显地不同。RNA-seq 主要用于研究转录组。应用该方法，获得的结果受到的干扰信号（background signal）比较低，更重要的是，通过RNA-seq有可能获得全新的转录产物（当然包括lncRNA在内，但是不局限于lncRNA。例如在肿瘤研究中，常用RNA-seq去发现新的融合基因。利用RNA-seq技术，研究人员发现某些lncRNA分子在神经精神疾病（neuropsychiatric disorder）中发挥重要作用。另有研究者通过RNA-seq技术，分析了肝细胞癌（HCC）中的整个转录组，当然也包括了lncRNA。（二）对于高通量数据的验证　　常用的验证高通量数据的实验手段有：Northern blot、qRT-PCR、FISH及RNAi 等方式。　　目前最为常用的检测lncRNA表达的手段是qRT-PCR，它的操作简单，自动化程度高，在实验室普遍使用。FISH的实验方法，使用的实验室就相对较少。FISH和Northern 类似的地方是，它同样是基于分子杂交的原理。使用FISH的一大优势是，它不仅可以表征lncRNA表达量的多少，更可以直观地告诉研究者lncRNA在亚细胞/组织中的定位。　　研究者成功地使用该方法研究了多条lncRNA，包括Xist、MALAT1、MENε/β和Kcnq1ot1等。RNAi是另一种广泛使用的实验手段，在细胞中特异性地敲减lncRNA，是检测lncRNA功能时，最常用的实验方法。例如，HOTAIR的5'区域和3'区域可以分别结合PRC2和LSD1，并起到一个脚手架（Scaffold）的作用。研究者通过RNAi的方式，敲减细胞内源性HOTAIR分子，证实了该分子在结构上的作用和功能。需要注意的是，以上的多种方法可以相互结合，以验证筛选获得的lncRNA的表达及其可能发挥的功能。----------------------------------------【解螺旋粉丝讨论会的问题荟萃】1. lncRNA最常用的套路有哪些？答：常用的套路有两种。一种是移植性研究（me too study）。直接把在其他肿瘤中已经研究过的lncRNA分子拿来，在自己的研究体系中加以验证。这类文章是很难上高分的；第二类是通过筛选。常用的筛选有两类：芯片和RNA-seq。相对而言芯片便宜些，但是只能在已知的分子中筛选具有差异表达的分子，RNA-seq 太烧钱，但是能发现新的分子。2. 使用包含lncRNA和miRNA的芯片是否合适？（粉丝：江龙-北京-心内）答：一张芯片上同时包含miRNA和lncRNA，甚至还包含mRNA及SNP等多种类型探针的芯片，被称为嵌合芯片。这类芯片通常情况下，检测的范围很广，但是检测的重复性并不能让人满意。至于是否要采用嵌合芯片，取决于实验目的。但是相对而言，同时检测lncRNA和mRNA是常见的，但是同时检测lncRNA和miRNA非常地少见。3. lncRNA的siRNA靶点预测怎么选？（粉丝：马艳娇）答：针对lncRNA的siRNA靶点预测，目前还没有特别有效的工具。只能靠运气和人品进行。相对省钱的方法是，先化学合成siRNA进行筛选，有效的siRNA再进行病毒包装。（感谢：林 温州 附一 神外）4. 国内lncRNA机制做的好的实验室有哪些？答：二军大孙树汉教授；中山大学附属第二医院宋尔卫教授；中国医学科学院曹雪涛教授；中科院系统的实验室。（感谢：长腿-南大；南京医科大-SQ ）5. 做筛选需要选用多少对样本？（孟令照-北京安贞医院-头颈肿瘤）答：理论上，三对样本就足够（一对样本指同一个病人的癌组织和癌旁组织）。但是为了筛选效果的可靠性和可重复性，建议最好6对样本或以上。（感谢：葛晓松-无锡-肿瘤）当然，如果是土豪，那么the more the better. （感谢：长腿-南大）6. 样本如何保存？答：用于RNA研究的样本保存，最重要的是两点：1）快速；2）低温。我们的方法是，学生拿着液氮罐等在主刀医生旁。一旦获得样本，立即放入液氮罐以防止降解。（感谢：南京医科大-SQ）【下期预告】：蛋白－lncRNA相互作用及研究方法，还有更多相关内容的网友问答精粹，敬请期待！“解螺旋lncRNA热点交流群”期待您的加入：群活动介绍1. 由解螺旋定期主题学习讨论2. 每期讨论结束后，投票决定下一期的讨论主题3. 每次讨论后解螺旋会整理此次讨论的精华结束后分享给大家。4. 每期邀请3-5名对主题熟悉的群友嘉宾进行主题讨论/辩论，欢迎主动报名5. 为了避免刷屏，客套话皆免。6. 群里禁止认识商业广告信息。7. 有需要分享的资源可以发邮件.cn,解螺旋这里制作网盘供大伙分享。　　由于目前群人数已经达到100人，无法直接扫群二维码加入，请想参加的小伙伴添加解螺旋微信助手（微信号：helixlife0）为好友并申请加入lncRNA群，助手会给您发送群邀请（微信会要求开通微信支付后才能入群）。助手二维码扫一扫（新版微信可长按图片识别图中二维码）2月我们精心为做科研的朋友搜集了 :2015年最新版国自然基金指南全文（PDF版）；年度）影响因子集DNAstar软件；引物设计软件GraphPad.Prism.v5.0.注册版；CA Cancer J Clin本月刚发布的《2012全球癌症统计》全文需要的朋友请转发此文到朋友圈后向解螺旋助手（微信号：helixlife0）索取下载链接！想每天看更多的实用科研文章，请上翻到顶部，点击标题下方“解螺旋”并“关注”，让解螺旋伴你孤单科研路，为你的科研加速！2014年解螺旋最受欢迎的文章：TCGA-高山仰止的癌症研究（索引号：1）临床基础科研的“七品”格调（索引号：5）科研方法论——技术流派 or 人脉流派？（索引号：10）医院科研圈，你住几环？（索引号：49）PPT制作六宗罪，你犯了几宗？（索引号：58）lncRNA系列（索引号：72. 73. 74. 172）用经营青楼的思想来做你的科研（索引号：79）miRNA数据库大全（索引号：89）5-10分SCI文章入门（索引号：100）评审专家谈国家自然科学基金上会评审情况（索引号：124）IF：3-4分和5分的文章差别（索引号：127）医学科研圈的装逼指南－－Bigger than bigger,岂止是装！（索引号：136）当高大上遇到真土豪，且看大牛们愉快的烧钱（索引号：141）从失败中浴火重生——酸菜关于阅读国自然评审意见的一点体会（索引号：143）医术再高，也怕菜刀——如何识别危险的医患关系（索引号：148）siRNA，shRNA，RNAi傻傻分不清楚（索引号：153）论不孝子是怎么形成的？工作太忙！当医生的你一定懂！（索引号：162）老谈信号通路系列（索引号：182. 189. 200）盘点这些年的基因敲减技术（索引号：183）中心法则虐我千万遍~（索引号：203）真相了，科研和男女关系没两样！（索引号：205）国自然专刊1-6（索引号：215. 216. 218. 220. 221. 222）标书中高大上的流程图是如何炼成的！（索引号：229）如需查看以上文章，请点击页面右上方或，点击“查看公众号”并关注！在解螺旋订阅号页面下方此处：输入相关索引号就可以查看对应的文章啦！
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