液溶液1ml并在室温或者37 温育2小时至过夜。 6.每孔加入2mlD-PBS润洗，在倒置显微镜下观察细胞，并估计蓝色细胞（β－gal－阳性）的比例。 7.如要保存培养板，每孔中加入1ml含有10%福尔马林的PBS，室温放置10分钟。用D-PBS润洗后4 保存在PBS中。 在转染细胞抽提物中测定β-gal表达 此实验方法用于测定细胞抽提物中β-gal活性。可以测定从96孔板到100mm培养皿转染所得的活性。此方法可适用于悬浮细胞（参见步骤2注意事项）。 裂解液：0.1％TritonX-100/0.1MTris-HCl（pH8.0）。 450ml蒸馏水 50ml1MTris-HCl（pH8.0） 0.5mlTritonX-100去垢剂 100 Mg溶液 0.1M氯化镁 4.5M2-巯基乙醇 4 保存 0.1M磷酸钠（pH7.5） 41ml0.2MNa2HPO4 9ml0.2MNaH2PO4 50ml蒸馏水 4mg/mlONPG（o-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷）溶于含有2mM2-巯基乙醇的0.1M磷酸钠（pH7.5），4 储存。 1M碳酸钠水溶液 使用GENETICIN 筛选抗生素(antibiotic)筛选稳定转染株 筛选所需的GENETICIN抗生素(antibiotic)的量会因细胞类型，培养基和血清成分的不同而不同。另外，如果使用粉末GENETICIN抗生素(antibiotic)，则需要计算每批抗生素(antibiotic)的剂量，因为效价会波动。或者使用GENETICIN抗生素(antibiotic)溶液，其活性会为100%。 一般使用100到1100μg/ml的GENETICIN抗生素(antibiotic)浓度筛选稳定的转染株，使用一半的筛选剂量保持培养的抗性。在转染前，使用您的细胞进行一个剂量-反应分析以确定杀死细胞的最低抗生素(antibiotic)浓度。可以使用稍高的浓度筛选稳定的转化子。 制备储液：50mg/ml 1.样品计算： 标记效价：700μg/mg 如配制10ml，需要500mg活性药品。因此需要的总的干重为714mg。 2.称量714mgGENETICIN抗生素(antibiotic)。 3.溶于10ml蒸馏水
4.无菌过滤。 或者，可以使用即时可用的溶液（无菌过滤），全效价为50mg/ml活性抗生素(antibiotic)
剂量-反应分析： 1.制备不含青霉素或链霉素的完全培养基。 2.加入0到22μl50mg/ml的GENETICIN抗生素(antibiotic)溶液（终浓度为0至1100μg/ml完全培养基，以100ug/ml梯度增加）。 3.使用胰酶消化细胞，稀释到4000细胞/ml。 4.在6孔板的每孔中加入100μl细胞悬浮液，每孔中已预先加入2ml含稀释GENETICIN抗生素(antibiotic)的培养基。将培养板在湿润的5%CO2中37 温育。每周使用含GENETICIN抗生素(antibiotic)的新鲜培养基更换培养基两次。 5.在10到14天，除去培养基，使用含钙离子和镁离子的D-PBS清洗细胞。使用溶于50%甲醇的0.5%亚甲基蓝染色细胞20分钟。 6.确定杀死所有细胞的
GENETICIN抗生素(antibiotic)最低浓度。使用紧邻的稍高的浓度进行筛选。 转染和筛选：
1.使用含编码抗生素(antibiotic)抗性基因表达序列的质粒（如pSV2neo）转染细胞。 2.转染后第二天，将细胞传代，给细胞分裂(cell pision)的空间（根据细胞生长的速度，一般1:10到1:40可以达到效果）。 3.转染后2-3天，开始使用抗生素(antibiotic)。将转染的细胞在含抗生素(antibiotic)的培养基中培养，抗生素(antibiotic)的浓度由剂量-反应分析确定。含抗生素(antibiotic)的培养基每周更换两次。 4.10到14天后，可以观察到抗性克隆，未转染的对照应该没有细胞生长。可以根据需要固定，染色，传代或克隆抗性细胞。
10.我准备研究某基因功能，构建了重组表达质粒（以荧光素酶为报告).现准备转染细胞，并以不含目的基因的质粒作对照。请问： 1.如果以beta-gal质粒共转染作内参，荧光素酶活性如何校正？ 2.如果以beta-gal质粒共转染作内参，各种条件转染需作复孔吗？ 3.各种条件转染均作复孔，结果经统计学处理，目的是排除孔间转染效率差异。是否还需要作共转染内参照？以β－gal为内参，只需将luciferase活性的值除以β－gal测的A值就行了。 复
孔应该做吧，不过不需要用此来平均转染效率，因为用beta－gal就可以消除转染效率的差异。为了简便，大多数的研究者，如楼上所说，把LUCIFERASE的活性值除以beta-gal的值就行了。但理论上讲是应该将内源性的beta-Gal活性扣除的，对于哺乳细胞，内部是有此酶活性表达的。所以，要设一个孔，任何DNA都不转染，然后把所有的beta-gal活性值都减去这个阴性对照的数值，最后把这个值与LUCIFERASE的活性做比，求出的比值为LUCIFERASE基因前面PROMOTER的活性。 PROMEGA有一种试剂盒，做内参照的不用beta-gal,是另一种LUCIFERASE，用不同的底物。这种酶在细胞内没有内源性的表达，结果更可靠些。 这个beta-gal一定要加，因为它是衡量转染效率的。它可是告诉你，是十个DNA转进去了，还是一百个。如果没有这个衡量标准，转进去了一百个DNA的LUCI活性当然强，如果跟转进去十个的比高不了多少，那事实上LUCI前的PROMOTER活性还是低。如果没有这个标准就会得出错误的结论了。 减去背景beta-Gal的时候不可直接减，要换成（活性/毫克）再减，这样相当于每个细胞里减去背景。同样的道理，做比值的时候也要把A值换成（活性/毫克）再与beta-Gal比。 不知说明白了没有。总之感觉处理数据很困难。总体的趋势应该和两值直接比差别不大（在背景比较小的时候。有的细胞背景就是高）。
11.可能你某个环节有污染，或者脂质体，或者质粒，或者培养基，最后就是你的器皿和操作。 首先你要排除这些问题，你应该做对照，就是单加质粒，单加脂质体，单加培养基，最后器皿全部重新消毒。这样子观察几个小时就可以知道是哪个物质加进去后会导致细胞死掉。 其次，你转染后一般4个小时就可以了，不要太长时间，还有我一个同学总结的经验是加脂质体的过程中，要每加一点就混匀一下，这样子，对细胞的损害小些。 试试吧，看能否解决你的问题。首先，转染细胞用的质粒必需保证无菌，一般的质粒提取试剂盒都不能做到这一点，我们通常都会将提完质粒后或者提的最后一步，用75％乙醇沉淀，这样就除菌了，离心后，再在超净台打开，用无菌水之类溶了，这应该是最常见的做法了。 其次，现在一般脂质体如lipo2000都是建议带血清转的，毒性很小，大多数转染导致的毒性都是提质粒带的大肠杆菌(Escherichia coli)裂解出来的内毒素，者这对原代细胞会产生很大的影响，而你提到的MDA-MB-231,Bcap-37,MCF-7三个都是细胞系，对内毒素不敏感，我转MCF-7随便用哪个盒子都能活的很好。现在也有不少公司，比如Qiagen，天为时代，卖的试剂盒都是去内毒素的，这样的试剂盒 对转原代比较好。阳离子脂质体与DNA的量之间的比例非常重要。对于一定量的DNA而言，所用的脂质体的量在一个范围之内，脂质体用量过多或过少都会降低转染效率。一般公司会给出其脂质体的优化使用方案。我用invitrogin公司的lipofectmine（2mg/ml）转染gfp质粒，293细胞，DNA：脂质体为100-150ng：1ul时效率最高。
12.MTT检测的是细胞的活性,即活细胞数的相对量,不可能用来检测转染效率.MTT检测最后细胞都碎裂,如何继续培养.可做三个平行孔,分别24.4872小时检测. 想做Western和，RT-PCR和流式的话，如果这些孔转染相同的质粒,当然可从其中几个孔的细胞做Western,再取另外几个孔的细胞作RT-PCR，再取别的孔的细胞作流式？其实瞬转质粒的效果都不好,建议还是做稳定表达.1.不同的细胞及转染试剂对于质粒和脂质体的比例要求是不同的，所以在正式实验前必须摸索一个最佳转染比例。总的来说，细胞系较原代好转，脂质体的用量以说明书为参考上下浮动。 2.对于转染后的效应检测，体外直接合成的SiRNA多半在48h检测，也有72H的，但时间再长有可能降解而失去功效。对于用U6或H1质粒载体体内转录生成siRNA的，因为有一个转录时间，所以检测可以稍靠后；而且，与体外合成的相比，
虽然载体也不能大量整合到细胞基因组中，但毕竟不会马上降解，Knockdown的时间效应相对要长，一般一周左右没有问题。所以可以在检测时做一个时间梯度，使实验数据更加丰满完善一些。（但要考虑靶细胞生长特性，疯长的可能效果较差）
13.本人想作质粒转染到帖壁细胞中，有以下细节想请教一下： １质粒如何提取才到达到要求？ ２摸索G418的工作浓度时用多少孔的板较好？ ３转染的KIT用国产的行否？ ４现在手头上有pcDNA3和pEGFPN1(C1)，我用哪一种好呢（实验目的：转的基因抑制和增强原细胞中的内源基因的表达）？ ５若用pEGFP，考虑到GFP可能会影响到目的基因的活性，所以想只表达目的基因（采用的方法就是在目的基因后带终止子），如此可行吗？ ６G418筛选后应该有单克隆出现，如何将此克隆挑出来扩大培养？ ７如何确定目的基因已转入成功呢（细胞中原来就有这种基因）？？？？ 1一般来讲，如果你的质粒分子量不是很大（小于10K,维特洁的超纯试剂盒提取的质粒就可以用来做转染的。 2至于G418的浓度，我认为你首先自己查查你所用的转染细胞适合的筛选浓度是多少，不一定用孔板来筛选的。 3我认为转染KIT组好还是质量好些的为妥。当然也不是完全这样，不用KIT，用普通磷酸钙转染也会得到很好效果的，呵呵 4如果这样的话，那你就同时构建2个载体好了呵，做个对照嘛， 5对于筛选的单克隆挑选，园子里有帖子的，你可以搜一下的，当然其它的应该也会有的，你搜一下会有很大帮助的。 以前做了六年的转染（用lipofectamine)，没碰到什么问题。现在到另一个实验室工作，改用lipofectamine2000，做了两个月的转染，没得到一点结果，而且不知错在什么地方。恳请大家指点，为我指点迷津。 我的实验操作： 1细胞在12孔板长至90%满底时进行转染。 2lipofectamine20003ul稀释于100ulRPMI-1640中 3质粒1ug（pcDNA3.1等）稀释于100ulRPMI-1640中 4混匀2和3。估计混匀前lipofectamine静置了5至10分钟， 因为有多组质粒需要转染 52和3的混合物室温静置20min 6转染前细胞用1640洗一次后，再加入600ul1640覆盖细胞 7将2和3的混匀物约200ul加至细胞表面，轻轻混匀 84至5小时后，将培养液换为含10%血清、谷氨酰胺和抗生素(antibiotic)的培养液 9继续培养20小时后，把转染细胞稀释传代 10传代24小时后加G418筛选 问题： 经抗性筛选后，形成的稳定细胞克隆数极少。我想lipofectamine2000和G418加压不存在问题，因为实验室有其它同事也在用lipo2000转染相同的细胞。重组质粒也不应该存在什么问题，因为我同时做了十几个不同的质粒克隆，包括含不同的抗性基因，用这些质粒做转染结果基本上是一样的。另外我用从公司买来的pcDNA3.1及pIRESneo转染也只能得到极少的稳定克隆。 我查阅了invitrogen公司的protocol，上面说RPMI来转染会降低转染效率，但我同事也是用它来转染的。我和我同事操做唯一不一样的地方可能是他们是用很高级的试剂盒来提取质粒（无内毒素活性，专用于细胞转染），而我用的是GIBCO的concertrapidkit，我感觉质粒纯度也应该是很不错的，比国内的试剂盒要好很多倍。这个试剂盒的质粒最后是用TE来洗脱的。invitrogen公司的protocol上说TE也会性降低转染效率，但我以前用手工提的质粒做转染效果也很好啊。真是无法理解。
14.！一般来讲，转染用的质粒要求是比较高的，这只是针对于纯度来说的，用土的方法抽提的质粒当然可以做，试剂盒本身也是溶液1，2,3的优化。只是手工方法提取的话，最好做一下酚氯仿抽提和PEG纯化，而且在这个过程中用水（包括试剂配制，溶解DNA等）都要用超纯水，目的就是去除内毒素的影响。 2不管社么时候做转染，放在-20度保存是比较
安全的，建议使用 3具体到转染目的不同，对质粒的要求也不一样，有的质粒能编码荧光蛋白，可通过荧光检测，也就是所说的报告基因质粒，有的具有真核生物可接受的抗生素(antibiotic)抗性，比如neo抗性，真核生物中可以通过G418进行筛选。其它的没什么不同的 4说到转染，提醒一句：转染试剂和质粒的比例一定要适当，如果需要抗生素(antibiotic)筛选的话，最好提前做一个剂量-致死反应，寻找最佳抗生素(antibiotic)筛选浓度。
15.有这种可能性。 1.是不是你转染时，脂质体和/RNA的混匀物加入后没有立即轻微振荡混匀？脂质体和DNA/RNA的混匀物只在孔的一处堆积造成的。 2.你加液时，枪吹打的太用劲了？最好让脂质体和DNA/RNA的混匀物一滴滴的滴下来。 3.板子本生就是有突出和凹陷的，不过常见于中心或者边缘出现特异性的大片死亡
或许有以下可能性 其实并非该细胞死亡（当然脱落后的细胞命运不佳），而是细胞本身贴壁性差，加完DNA－转染试剂后，晃动培养板混匀，加上来回转移六孔板等等物理因素导致月牙状细胞脱落 细胞脱落时常为月牙状 我养的Phoniex细胞经常如此 推荐解决方法： Poly－D－lysine包被板培养板
16.不同的转染试剂，不同的转染方法对不同的细胞的毒性都是不一致的，就像磷酸钙转染法最293t细胞毫无损伤，而且转染效率还奇高。而对hela细胞转染效率几乎为0，而且毒性奇大。 像公司的转染试剂盒也是针对不同细胞的。所以楼主的问题既没有说清楚你的细胞是什么，也没有说清楚你的转染方法是什么，希望你能说清楚。 至于你所说的的现象，我用invitrogenlipo2000,也曾经经历过。六个小时已经足够质粒进入细胞，进行下一步的蛋白表达，所以如果你经过检测6小时换液的方法转出来的转染效率足可以满足你的实验要求，就可以6小时将混悬液换掉。
转染应用不同的方法就会有不同的效果喔。对于ｌｉｐｏ２０００，我用的是肿瘤细胞株中的口腔上皮癌那种，建议从开始种板就用新鲜无双抗有血清培养液，至于转染所需要的时间，5-6小时是常规，可以再增加或减少1-2小时，主要根据你自己当时的细胞状态和要求的转染效率而定。实际上，镜下来看，总是容易出现一些死亡细胞的。
17.1）“请教主任及各位大虾，稳定转染的机制是什么？”稳定转染的本质是目的基因在宿主细胞染色体上的稳定整合和稳定表达。 2）”一个表达质粒其基因是怎样整合到基因组DNA的？”表达质粒的整合机理一般是随机整合，即整合的位置没有规律，这类载体是主流，如pcDNA系列和pCI系列等等。极少数的情况下，有利用位点特异性重组酶或同源重组进行染色体定点整合的可能，但这些多局限与研究，商品化的东西几乎没见过。 3）“用G418筛选出细胞系后，用RT-PCR检测有mRNA表达，用Western总检测不到蛋白？”Western阳性对照和RT-PCR的阴性对照正常吗？如果都正常，那说明转录后和翻译机制可能有问题。检测表达还是以蛋白为主，毕竟转录以后影响最终表达量的因素还是不少的。工具类服务
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TPX2基因对宫颈癌生物学作用的实验研究
目的：TPX2(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein2是一个受细胞周期严格调控并在细胞有丝分裂纺锤体形成过程中发挥重要作用的微管相关蛋白。有研究者发现其在某些恶性肿瘤中存在高表达，导致细胞中心体异常扩增、异倍体形成及细胞恶性转化，进而促进细胞增殖，影响周期和凋亡，并与肿瘤分化、转移和复发明显相关。阻断其表达可抑制止肿瘤细胞生长，有望成为肿瘤治疗的候选靶点。宫颈癌是妇科常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展和转归与多种因素有关。TPX2是否参与其中，目前国内外尚未见报道。本课题研究了TPX2在宫颈癌的表达及在体内外沉默后对宫颈癌细胞增殖、侵袭的影响，旨在为宫颈癌诊治开拓新的靶点。　　方法：本课题分总共分四部分，第一部分借助RT-PCR及免疫组化技术对宫颈癌组织、鳞癌siha细胞及腺癌hela细胞中的TPX2在的表达进行研究，并结合临床病理资料进行分析，以探讨TPX2在子宫颈癌中的表达情况及其与子宫颈癌患者临床分期、淋巴结转移及组织病理分化程度的关系，为宫颈癌的诊治提供新的依据。第二部分研究了在宫颈鳞癌siha细胞沉默TPX2基因后其生物学行为的变化。在体外合成TPX2特异性的siRNA四对，siRNA阴性对照一对。Lipofectamine2000介导siRNA转染siha细胞株。荧光显微镜测其转染效率。本实验所有检测项目都按如下分组：实验中以PBS代替转染剂和siRNA混合物设置为空白对照组，转染阴性siRNA为阴性对照组，转染TPX2-siRNA者为实验组。RT-PCR检测转染前后mRNA表达的变化，并选择出最有效的siRNA做后续实验。Western blot检测转染前后蛋白表达的变化。MTT法检验TPX2-siRNA对siha细胞增殖活性的改变：每组设3个平行孔，将各组细胞分别接种至96孔板培养24小时，按照操作步骤进行转染，分别于转染后0小时、24小时、48小时、72小时、96小时，用酶联仪于570nm处检测各孔吸光度值，并据此绘制细胞生长曲线。流式细胞仪检测TPX2沉默后siha细胞的周期和凋亡的变化。Transwell体外侵袭实验测定TPX2沉默后siha细胞侵袭能力的改变：将各组细胞滴加于Matrigel包被的含有微孔滤膜的Transwell小室，培养24小时，95％乙醇固定，结晶紫染色，显微镜下计数各组穿膜细胞数。第三部分研究了TPX2-siRNA对人宫颈腺癌hela细胞体外生长的影响，方法同第二部分。为了进一步验TPX2特异性的siRNA在体内对宫颈癌细胞生长的影响。第四部分研究了TPX2-siRNA对裸鼠皮下HeLa细胞移植瘤生长的影响。实验所用siRNA经2'Ome修饰，与lipo2000孵育后转染Hela细胞及瘤体内注射。实验裸鼠分组：TPX2-siRNA转染组(接种转染TPX2-siRNA的hela细胞成瘤)，siRNA阴性对照组(接种转染阴性siRNA的hela细胞成瘤)，TPX2-siRNA治疗组(接种hela细胞成瘤后，TPX2-siRNA瘤内定期注射治疗)，空白对照组(接种hela细胞成瘤后，生理盐水瘤内定期注射治疗)。通过观察各组裸鼠皮下移植瘤的成瘤时间、绘制移植瘤体积生长曲线，移植瘤体积和重量的对比、RT-PCR、免疫组织化学法来研究TPX2-siRNA对TPX2基因的沉默效应及TPX2-siRNA对HeLa细胞裸鼠移植瘤的抑制效果。　　结果：　　第一部分①经RT-PCR检测，正常宫颈组织中。TPX2 mRNA的相对表达量为0.080±0.030，宫颈腺癌组织中TPX2mRNA表达为0.467±0.031，宫颈鳞癌组织中相对含量为0.441±0.011，HeLa细胞的表达为1.923±0.040，Siha细胞的表达为1.679±0.042，各组与正常宫颈组织比较均有统计学差异(P<0.01)。②经细胞免疫化学检测，TPX2蛋白在宫颈鳞癌Siha细胞和宫颈腺癌hela细胞系均呈阳性表达，定位于细胞核。免疫组化法检测TPX2蛋白在宫颈腺癌组织呈阳性表达，而正常宫颈腺上皮未见表达，两组间比较有统计学意义。TPX2蛋白在正常宫颈鳞状上皮组织中不表达，在CIN和宫颈鳞癌组织中阳性表达强度增加，三者之间差异具有显著性((P<0.05)。③TPX2在宫颈癌患者临床分期Ⅱ期的组织中的表达强度强于Ⅰ期(P＜0.05)；TPX2蛋白在高、中、低分化三组间的表达强度渐增加，三组间比较有统计学意义，(P<0.05)；在有淋巴结转移组的表达强于无淋巴结转移组(P＜0.05)。　　第二部分①在600μL转染体积中，在siRNA浓度为20μmoL/L时，siRNA和Lipoectamine:2比例搭配时，siha细胞的转染效率24h为(97.13±1.82)％。②四对TPX2-siRNA尤以TPX2-siRNA4的TPX2mRNA沉默效果最强，TPX2mRNA抑制率为(84.9±0.73)％。③TPX2-siRNA4被转染后，siha细胞的TPX2蛋白表达被明显抑制，抑制率达(62.5±1.26)％。④MTT法测定TPX2 siRNA4干扰TPX2基因对siha细胞增殖的影响：转染TPX2 siRNA4组的siha细胞在转染24h后均即出现增殖减慢，48h吸光度开始出现下降趋势，细胞增殖受到抑制，且随着时间延长，抑制作用逐渐增强。在转染24、48、72、96h时间点的吸光度值均显著低于空白对照组及转染阴性siRNA对照组(P0.05)。⑤Transwell小室法测定TPX2 siRNA4干扰TPX2基因对siha细胞体外侵袭能力的影响：TPX2 siRNA4转染siha细胞后使其侵袭重建基底膜能力受到显著抑制，Siha细胞侵袭到Transwell小室滤膜下的细胞数在TPX2-siRNA4转染组为(12.33±3.06)显著低于空白对照组(50.67±5.52)和阴性对照组(48.33±4.04)(P0.05)。⑥流式细胞术检测TPX2-siRNA4对siha细胞周期分布的影响。经流式细胞仪检测分析，TPX2-siRNA4转染siha细胞后，其周期分布在各组也发生了明显的变化，TPX2-siRNA实验组与空白对照组及阴性对照组相比，G0/G1期细胞比例减少(P<0.05，)，S期细胞及G2/M期细胞比例增多(P0.05)。⑦流式细胞术检测转染TPX2-siRNA对siha细胞凋亡的影响：根据流式细胞仪检测siha不同组细胞凋亡情况的结果显示，TPX2-siRNA4转染siha，细胞后TPX2-siRNA4转染组、siRNA阴性对照组、空白对照组的细胞凋亡率分别为10.45±0.63％、3.05±0.28％、2.26±0.46％，转染组细胞凋亡率明显高于阴性对照组的和空白对照组P0.05)。　　第三部分 TPX2-siRNA对人宫颈腺癌hela细胞体外生长的影响①TPX2-siRNA成功转染hela细胞，24h转染效率为(98.33±1.53)％②四对TPX2-siRNA尤以TPX2-siRNA4的TPX2mRNA沉默效果最强，TPX2mRNA抑制率为(82.5±0.43)％。③TPX2-siRNA4被转染hela后，其蛋白表达被明显抑制，抑制率达(63.4±1.05)％。④MTT法测定TPX2siRNA4干扰TPX2基因对hela细胞增殖的影响：转染TPX2 siRNA4组的hela细胞在转染24h后均即出现增殖减慢，48h吸光度开始出现下降趋势，细胞增殖受到抑制，且随着时间延长，抑制作用逐渐增强。在转染24、48、72、96h时间点的吸光度值均显著低于空白对照组及转染阴性siRNA组(P0.05)。⑤Transwell小室法测定TPX2 siRNA4干扰TPX2基因对hela细胞体外侵袭能力的影响：TPX2 siRNA4转染hela细胞后使其侵袭重建基底膜能力受到显著抑制，hela侵袭到Transwell小室滤膜下的细胞数在TPX2 siRNA4转染组为(13.20±1.92)显著低于空白对照组(55.20±1.30)和阴性对照组(55.40±2.07)(P0.05)。⑥流式细胞术检测TPX2-siRNA4对hela细胞周期分布的影响。经流式细胞仪检测分析，hela细胞周期分布发生改变，与对照组相比，TPX2-siRNA4实验组细胞G0/G1期细胞比例下降(P<0.05，)S期细胞及G2/M期细胞比例上升(P0.05)⑦流式细胞术检测转染TPX2-siRNA对hela细胞凋亡的影响：TPX2-siRNA4转染组、siRNA阴性对照组、空白对照组的细胞凋亡率分别为13.47％±0.60％、3.48％±0.55％、2.73％±0.51％，转染组细胞凋亡率明显高于阴性对照组的和空白对照组，差异具有统计学意义(P0.05)。　　第四部分①各组裸鼠皮下移植瘤成瘤情况：转染组约在9.37±0.75天后于接种处可触及粟粒大小的结节，之后结节渐长大，即为建模成功，成瘤率为100％。其它三组均在接种约4天后可触及粟粒大小的结节，并渐长大，即为建模成功，各组成瘤率均为100％。转染组与其它三组成瘤时间比较，差异有统计学意义。②各组裸鼠皮下移植瘤体积生长曲线显示，空白组和阴性对照组生长速度较快，转染组和治疗组肿瘤的生长均不同程度的受到了抑制。③接种30天后各组裸鼠皮下移植瘤体积TPX2-siRNA转染组为252.13±27.45；TPX2-siRNA治疗组为133.45±7.41；空白对照组体积为6.73；siRNA阴性对照组体积为7.80，空白对照组和阴性对照组体积明现大于转染组和治疗组体积，差异有统计学意义(P0.05)。空白对照组和阴性对照组移植瘤的体积和重量分别比较无明显差异(P>0.05)。转染组、治疗组移植瘤的体积和重量与空白对照组、阴性对照组相比明显减小，其差异具有统计学意义(P<0.05)。⑤各组裸鼠移植瘤中。TPX2mRNA的表达：TPX2-siRNA转染组、TPX2-siRNA治疗组TPX2mRNA和空白对照组、siRNA阴性对照组TPX2mRNA相比均有统计学意义(P<0.05)，TPX2-siRNA治疗组与TPX2-siRNA转染组相比具有统计学意义(P05)，⑥免疫组化检测各组裸鼠移植瘤中TPX2蛋白的表达：TPX2蛋白表达定位于细胞核，TPX2-siRNA转染组和治疗组TPX2蛋白的表达明显弱于空白对照组及siRNA阴性对照组(P05)。　　结论：　　1.TPX2可能参与了宫颈癌的发生和发展，TPX2可作为宫颈癌诊断及恶性程度评估的一个指标。　　2.TPX2-siRNA在体外能抑制宫颈鳞癌siha细胞的增殖和侵袭，使细胞周期停顿于S期及G2-M期，并诱导细胞凋亡。　　3.TPX2-siRNA在体外能抑制宫颈腺癌hela细胞增殖和侵袭，使细胞周期停顿于S期及G2-M期，并诱导细胞凋亡。　　4.TPX2-siRNA能沉默裸鼠体内hela细胞移植瘤TPX2的表达，进而抑制裸鼠体内hela细胞移植瘤的生长。　　5.TPX2有望成为宫颈癌基因治疗的候选靶点，有潜在的临床应用前景。
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Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达_李红雨_图文
导读：Pin1基因真核表达载体的构建及在，宫颈癌HeLa细胞中的表达，摘要目的构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基，方法从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA，结果RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体，结论重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效，关键
第36卷第5期第633页华中科技大学学报(医学版)Vol.36　No.5　P.633
　　　　　　　　
2007年10月ActaMedUnivSciTechnolHuazhongOct.　2007
Pin1基因真核表达载体的构建及在
宫颈癌HeLa细胞中的表达
李红雨1,2　　朱　涛1　　周金华1　　徐　茜1　　胡春霞1
邓东锐1　　王世宣1　　卢运萍1　　马　丁1△
华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科,武汉　430030郑州大学第三附属医院妇产科,郑州　450052
摘要　目的　构建一种含人肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1的质粒,以绿色荧光蛋白作为报告基因,观察其在宫颈癌HeLa细胞中的表达。方法　从人宫颈癌HeLa细胞中,以RT-PCR方法扩增出人Pin1基因全长cDNA序列(CDS),插入增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1,脂质体法转染HeLa细胞,荧光显微镜下观测绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法检测GFP-Pin1蛋白的表达。结果　RT-PCR扩增出人Pin1基因;构建pEGFP-C1-Pin1重组质粒,体外成功转染入宫颈癌HeLa细胞,在荧光显微镜下可见强绿色荧光蛋白的表达,免疫印迹法证实存在GFP-Pin1蛋白高表达;经G418筛选获得单细胞克隆。结论　重组质粒pEGFP-Pin1体外转染HeLa细胞后,目的基因能够在细胞内有效表达,检测方法简便可靠,为利用转染该目的基因的细胞进行下一步研究提供了实验基础。
关键词　肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1;　质粒构建;　基因转染中图法分类号　R737.33
ConstructionofpEGFP-Pin1RecombinantPlasmidand
ItsExpressioninCervicalCancerCellLine
,ZhuTao,ZhouJinhuaetal
DepartmentofObstetricsandGynecology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,　　HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan4300302
DepartmentofObstetricsandGynecology,theThirdAffiliated　　Hospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052
Abstract　Objective　Toconstructavectorcontaininghumanpeptidyl-prolylcis/transisomerasePin1withgreenfluores-cenceproteinasthereportergene,andthentoobserveitsexpressioninHeLacells.Methods　TheCDSofPin1wasamplifiedfromHeLacellsbyRT-PCR,thenligatedwithpEGFP-C1toformrecombinantplasmidpEGFP-Pin1andtransfectedintoHeLa
cells.GFP-taggedPin1subcellularlocalizationwasanalyzedbyfluorescentmicroscopy,andtheGFP-Pin1wasdetectedbyim-munoblotting.Results　TherecombinantplasmidpEGFP-Pin1wasconstructedandtransfectedintoHeLacellssuccessfully.
Pin1localizedalmostexclusivelyinthecellnucleusspecklesandconcentratedatdiscretestructures.TheGFP-Pin1wasstronglyexpressedinHeLacells.ThestabletransfectedclonewasselectedbyG418.Conclusion　RecombinantplasmidpEGFP-Pin1was
effectivelyexpressedafterbeingtransfectedintoHeLacells,whichprovidedthelabsupportforfurtherstudyonPin1.
Keywords　peptidyl-prolylcis/transisomerase,PPIasePin1;　　genetransfection
　　Pin1主要调节有丝分裂相关蛋白酶,对细胞增殖和恶性转化起着非常重要的调节作用。我们前期研究显示:Pin1在宫颈癌组织中存在过表达,从正常宫颈到宫颈上皮内瘤样病变(CIN)再到浸润癌的过程中Pin1蛋白表达逐渐增强;Pin1过表达与Cy-clinD1、Ki67表达呈显著正相关。提示Pin1可能通过调控CyclinD1表达诱发细胞转化和增殖失
*国家重点基础研究发展计划(973)基金(No.
控,参与宫颈癌发生发展。为研究Pin1基因功能,我们应用Clontech公司经定点突变技术改造成功的GFP突变型真核表达载体pEGFP-C1,将新基因Pin1cDNA开放阅读框与EGFP的C末端融合,成功构建了重组真核表达载体,转染宫颈癌HeLa细胞并检测其表达,为进一步对Pin1在宫颈癌发病中作用和机制的研究奠定实验基础。1　材料与方法
1.1　材料与试剂
家自然科学基金(No.)资助项目李红雨,女,1964年生,主任医师
华中科技大学学报(医学版)　　2007年10月第36卷第5期
心(AmericanTypeCultureCollection,ATCC),由同济医院妇科肿瘤实验室传代培养。DMEM培养液为Gibco(Invitrogen美国)公司产品,Hepes和胰蛋白酶为美国Sigma公司产品,新生牛血清为杭州四季青公司产品。增强绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1购自美国BDBiosciencesClontech公司,在大肠埃希菌DH5-α株中扩增。脂质体转染
试剂Lipofectamine2000为美国Invitrogen公司产品。T4DNA连接酶及Trizol试剂、鼠白血病病毒逆转录酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP),oligo-dT、耐热DNA聚合酶,质粒抽提试剂盒均购自美国Promega公司。PCR产物纯化试剂盒QIAquikPCRPurificationKit购自荷兰QIAGEN公司。限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ购自大连宝生物公司。兔抗人多克隆抗体Pin1、鼠抗人单克隆抗体β-actin购自美国SantaCruz公司。辣根过氧化物酶标记的鼠抗兔、兔抗鼠二抗均购自美国SantaCruz公司。增强化学发光显色系统ECL购自以色列Bi-ologicalIndustriesKibbutzBeitHaemek公司。PCR引物合成及DNA测序由美国Invitrogen公司上海分部完成。
述PCR产物,按QIAquikPCRPurificationKit说明书操作,纯化目的基因片断。取少量纯化产物测浓度,取30μgDNA,配制100μl反应体系,双酶切纯化的PCR产物及pEGFP-C1载体。将上述酶切产物再次纯化,测浓度,琼脂糖凝胶电泳,若杂带多再行玻璃奶回收纯化,按玻璃奶回收试剂盒说明书操作。1.2.3　DNA片断定向连接及重组质粒转化大肠埃希菌　取上述纯化产物,按质粒∶目的片断1∶3～5摩尔比进行连接,连接体系20μl,室温3h,65℃温育10min终止酶反应,使目的DNA片断定向插入pEGFP-C1载体。按重组质粒转化大肠埃希菌的常规步骤操作,将连接产物10μl加入感受态,冰上30min,同时以线性pEGFP-C13μl作阴性对照,环性pEGFP-C1作阳性对照。42℃加热90s,置冰上,加950μl不含抗生素的LB培养液,37℃,摇床150r/min×60min。从每管取0.2ml菌液,分别加入LB琼脂平板(含卡那霉素),将平板倒置放在37℃温箱中培养过夜,次日观察转化子出现的数目。
1.2.4　含重组质粒的细菌菌落鉴定　从平板上挑选6个转化子菌落,分别接种到2.5ml含有卡那霉素(50μg/ml)的LB培养液中,37℃振荡培养过夜,行质粒小提,酶切鉴定。酶切产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳,采用80V电压,约30min,分析DNA区带。将含有目的片断的转化子菌落保种,同时送In-vitrogen公司测序。
1.2.5　重组质粒中量提取　将测序正确的单一菌落接种入盛有200mlLB培养液(含50μg/ml卡那霉素)的500ml三角瓶中,置37℃振荡培养过夜(置摇床中,150r/min),将培养物转入50ml塑料离心管内,50ml/管,按质粒中量提取试剂盒说明书操作,提取质粒,取少量样品行紫外分光光度仪分析以及琼脂糖凝胶电泳鉴定质量。
1.2.6　细胞培养及转染　取对数生长期、状态良好的HeLa细胞,计数,接种6孔板,密度4.5×105个/孔。待细胞融合达90%～95%,用脂质体Lipo2000转染HeLa细胞,按脂质体LipoTM2000说明书操作。转染4～6h换液,加入完全培养液终止转染。转染后48h用荧光显微镜直接观察细胞内绿色荧光,收获部分细胞检测基因表达,同时行稳定筛选。于转染后48h加入G418,终浓度为800μg/ml,连续应用2周,挑取肉眼可辨的单克隆细胞,以G418终浓度为500μg/ml继续培养,获得稳定转染细胞。
1.2.1　PCR引物的设计及目的基因片段的获得　根据GeneBank中报道的Pin1基因(No.BC002899)cDNA序列的开放阅读框架,结合BD
BiosciencesClontech公司载体说明书,Oligo软件优化设计出上、下游引物,在上游引物中加入EcoRⅠ酶切位点,下游引物中设计了BamHⅠ酶切位点,由Invitrogen公司合成。正向引物序列:5′-AGGGAATTCGATGGCGGACGAGGAGAAGCT-GC-3′,反向引物序列:5′-CATGGATCCGCTC-CCCACCCTCACTCAGTGC-3′,从HeLa细胞RNA中RT-PCR扩增出Pin1基因全长cDNA序列。宫颈癌HeLa细胞呈贴壁生长,培养于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的DMEM完全培养液,置于含5%CO2、饱和湿度、37℃恒温培养箱中培养。取对数生长期、状态良好的HeLa细胞,TrizolTM试剂一步法提取细胞总RNA,取5μg总RNA用M-MLV逆转录酶进行逆转录,50μl反应体系PCR扩增Pin1基因全长cDNA序列。反应条件:94℃,预变性594℃,变性30s;58℃,退火60s;72℃,延伸90s,30个循环;72℃,末次延伸7min,4℃保存。1.5%琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察。
李红雨等.Pin1基因真核表达载体的构建及在宫颈癌HeLa细胞中的表达
粒pEGFP-C1-Pin1+或对照空质粒pEGFP-C1的HeLa细胞,参照《分子克隆实验指南》方法[3]提取总蛋白,以β-actin作为等量蛋白上样对照,每个样本至少重复3次,比较两组细胞中Pin1的表达。取50μg蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳,并转至硝酸纤维素膜上;以5%脱脂奶37℃封闭1h后,用含0.05%Tween20的TBS缓冲液(TBST)漂洗3次,每次10加入相应的兔抗人Pin1、鼠抗人β-ac-tin多克隆抗体(1∶200,1∶500),4℃孵育过夜,TBST漂洗3次后,加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶5000),37℃摇床温育2h,增强化学发光显色系统显色。2　结果
2.1　重组质粒鉴定
对和预测其二级结构,该位点是Pin1基因的多变位点,它的丢失将不影响Pin1的二级结构和功能。在我们的实验中,HeLa细胞被转染pEGFP-Pin1后,使用荧光显微镜观察可清晰看到核颗粒的增强绿色
荧光,而转染pEGFP-C1空载体的HeLa细胞,绿色荧光蛋白布满整个细胞,见图4。提示该碱基丢失不影响编码蛋白GFP-Pin1的结构和功能
从宫颈癌HeLa细胞RNA中扩增出Pin1基因全长cDNA序列,条带位置正确(图1),并成功连接至pEGFP-C1质粒,经酶切可见插入目的片断约
515bp,见图2。测序鉴定结果显示:目的基因Pin1的阅读框与载体克隆位点的阅读框匹配,无移码突变,但重组质粒pEGFP-Pin1从第82位至87位丢失6个碱基,编码分别对应于Pin1第19、20位的丝氨酸和甘氨酸,见图3。经PubMed上GenBank比
图1　RT-PCR扩增Pin1基因全长cDNA
1:M2:pEGFP-C1;3:pEGFP-Pin1
重组质粒双酶切鉴定
图中所圈之处为丢失碱基和对应的氨基酸
华中科技大学学报(医学版)　　2007年10月第36卷第5期
PCR发生错误的可能性较小,碱基缺失与选用的细胞株可能有关。查阅Pubmed上GenBank得知:第82位至87位碱基是Pin1基因的多变位点,已知有6种不同的变异方式,而该6位碱基全部缺失是其中的一种变异。Pin1是一种分子量很小的蛋白(18
A:转染pEGFP-C1空载体的HeLa细胞,绿色荧光蛋白布满整个细胞(×400);B:转染重组质粒pEG-FP-Pin1后,除胞质见绿色荧光外,尚可清晰看到胞核内增强的绿色荧光颗粒,如箭头所示(×800)图4　倒置荧光显微镜观察转染后HeLa细胞内绿
kD,1kD=0.9921ku),本身不含有核定位信号,它在细胞内的定位主要通过WW区和底物相互作用
而决定[4]。在多种细胞类型的癌组织中Pin1在胞质胞核均表达,这可能是由于在体内胞核胞质中有较多Pin1底物存在的缘故。Pin1主要调节有丝分裂相关蛋白酶,对细胞周期运行起着非常重要的调节作用。依赖Pin1的构象转变是新发现的蛋白磷酸化后调节机制,它可能作为一种计时机制,允许细胞以一种高效而精确的方式打开或关闭某些磷蛋白的功能,从而参与基因表达、细胞分化、胚胎发育等生命现象的调控。这种复杂信号机制的失调可导致细胞转化和肿瘤发生[6-7]。在熟知磷酸化对蛋白质功能的重要影响以后,Pin1催化的构象转变作为一个新的磷酸化后调节机制,其在细胞增殖和转化中的关键作用越来越被人们关注[8]。
我们成功构建了Pin1基因真核表达载体,转染宫颈癌HeLa细胞后,GFP-Pin1融合蛋白高表达并
转运定位于HeLa细胞核内,可能在HeLa细胞核中具有激活其它基因表达的功能。通过G418筛选得到稳定转染pEGFP-Pin1的细胞株,为进一步研
究Pin1功能奠定实验基础。
参　考　文　献
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2.2　免疫印迹检测基因表达
收获转染细胞行免疫印迹检测。结果显示,GFP标记的融合蛋白Pin1有较强表达,且随着
Pin1表达增强,内参照β-actin表达无改变。与He-La细胞和转染空质粒pEGFP-C1的细胞比较,pEGFP-Pin1转染组细胞Pin1融合蛋白表达明显增强,差异有显著性意义(P&0.05),见图5
1:HeLa;2:pEGFP-C1;3:pEGFP-Pin1
图5　免疫印迹检测基因表达
pEGFP-C1真核表达载体在哺乳动物细胞中有很好的转染效率和表达,选用445～490nm的激发
光源,可见强烈的绿色荧光。在实验中我们用脂质体转染试剂LipoTM2000转染HeLa细胞,转染24～48h后,观察到目的蛋白GFP-Pin1在细胞内的
表达情况。pEGFP-C1空载体转染组,可见绿色荧光蛋白布满整个细胞;而pEGFP-Pin1转染组,融合有绿色荧光蛋白的目的蛋白可聚集于细胞核内,除胞质见绿色荧光外,尚可见胞核内增强的荧光颗粒,与文献报道一致[1]。说明目的蛋白GFP-Pin1的结构和功能不受氨基酸丢失的影响。我们在重复实验后获得了类似结果,因而推测在质粒构建过程中,
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