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【关键词】&&肾炎
　　【摘要】&&目的&&大鼠Heymann肾炎（HN）是人类膜性肾病的经典动物模型，其发病机制的研究推动了人们对膜性肾病的理解。Megalin是HN主要致病抗原，也是低密度脂蛋白受体家族成员，其胞外结构形成的4簇配体结合区域均可能存在抗原决定簇。本实验拟克隆其第2簇配体结合区域，并表达融合蛋白，为进一步研究其抗原决定簇的确切位置及其功能打下基础。方法&&采用RT-PCR获得大鼠肾目的片段Megalin基因，再与原核表达质粒pTrcHis A结合构建重组质粒，然后将重组质粒转入TOP10细菌诱导表达融合蛋白，最后用Western-Blot检测表达的融合蛋白。结果&&（1）RT-PCR获得的目的片段大小为1kb，测序证实为Megalin基因;测序报告还显示有3个突变，分别位于Megalin基因的、3702，其中前两个突变都不影响融合蛋白的氨基酸序列，第3个突变则将赖氨酸变成谷氨酸，经分析对融合蛋白表达无明显影响。（2）构建的重组质粒用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，得到预期的2个片段4.4kb和1kb，分别表示质粒pTrcHis A和Megalin基因。（3）用IPTG诱导TOP10（含有重组质粒）融合蛋白表达后，经Western-Blot检测发现了38kD的目的蛋白。阳性对照TOP/CAT在IPTG诱导前没有出现蛋白条带，在IPTG诱导后4h出现蛋白条带；阴性对照TOP10（不含有质粒）和TOP10（含有pTrcHis A）经IPTG诱导后均无目的条带出现。另外，融合蛋白的表达量在IPTG诱导后4~6h增加明显。结论&&成功构建了重组表达质粒（带有Megalin基因的pTrcHis A）；成功诱导了融合蛋白的表达，为进一步研究Megalin基因抗原决定簇的确切位置及研究Megalin的功能提供了基础。
　　【关键词】&&肾炎;基因;表位;融合蛋白
　　【Abstract】&&Objective&&Rat Heymann nephritis（HN）is a classic model of human membranous nephropathy.Research of its pathogenesis help understand the human membranous nephropathy.Megalin is the major antigen of HN,and it is also a member of the low density lipoprotein receptor gene family；its extracellular region can bind multiple ligands,and this extracellular region form four clusters of ligand-binding domains containing pathogenic epitopes.So we cloned the second cluster of ligand binding repeats and express the recombinant proteins containing N-Terminal 6xHis tags.This study was aimed to provide the basis to precisely locate the pathogenic epitope and help understand its function.Methods&&We applied reverse transcription PCR to obtain objective band（Megalin gene ）,then constructed the recombinant plasmid by inserting this fragment into pTrcHis A.After the recombinant plasmid was transfected into TOP10,the expression of 6xHis fusion protein was induced by isopropylthio-β-D-galactoside（IPTG）.Finally Western-Blot was performed to detect the fusion protein.Results&&RT-PCR showed the size of object band wss 1kb.After recombinant plasmid were digested with BamHⅠand EcoRⅠ,we obtained two fragments:one size was 1kb,the other was 4.4kb.Western-Blot showed the fusion protein size was 38kD，and the yield of fusion protein was obviously increased at 4~6 hours by IPTG inducing.Conclusion&&We succeed in constructing recombinant plasmid and obtaining the fusion protein,which may provide basis for further study.
　　【Key words】&&fusion protein
　　膜性肾病是儿童及成人常见难治性肾脏疾病之一，以上皮下免疫复合物的沉积致肾小球基底膜增厚和蛋白尿为特征；其发病机制尚不清楚，现有对膜性肾病的认识很多来自于其经典动物模型Heymann肾炎（HN）的研究。因此，对Heymann肾炎的分子免疫病理机制的研究将有助于提高对膜性肾病的认识，从而改进治疗。
　　现已明确Megalin（也称gp 330）是HN的主要致病抗原成分，在肾脏主要表达于近端小管的刷状缘和肾小球上皮细胞的胞被小凹中［1,2］。它是一个跨膜糖蛋白，属于低密度脂蛋白受体家族成员，胞外区形成4簇潜在的受体配体结合区域［3］；可与多种配体结合，包括受体相关蛋白（RAP）、血纤维蛋白溶酶原、细胞外基质成分、纤溶酶原激活因子和纤溶酶原激活因子抑制物Ⅰ型复合物、载脂蛋白E富集的β-VLDL、脂蛋白脂肪酶、乳铁转移蛋白以及钙离子、胰岛素等［4~7］。对Heymann肾炎中Megalin可能与RAP结合形成HN抗原复合物，再与循环中的抗体结合形成原位免疫复合物，导致肾小球的损伤和继之的大量蛋白尿［4,8］。
　　对Heymann肾炎抗原的研究认为Megalin和RAP上均存在抗原决定簇。RAP上的抗原决定簇定位在N末端的15个氨基酸（39-44氨基酸）［9,10］；国内研究认为RAP C末端的108个氨基酸多肽也可能存在Heymann肾炎病理性表型,而对Megalin的抗原位点的分析因其分子量大，目前尚不清楚。Akihiko Saito等研究发现4簇配体结合重复序列表达蛋白中，仅第2个配体结合区域表达的蛋白能被检测到；确定第2簇配体结合区域中的46个氨基酸（氨基酸，也是第5个配体结合重复序列）包含主要的抗原决定簇［11］，第2簇配体结合区域包含的结合位点，可与RAP及其他配体结合，而其他3簇配体结合区域则未见参与［6］。Andrew V.Oleinikov等研究发现Megalin N末端一个60kD的片段（它定位在Megalin基因的第1簇配体结合区和第1个YWTD分隔区域,可能部分或者全部包含在Megalin的180-453氨基酸残基中）可以和Megalin完整的分子一样诱导完全的主动型HN，因此他们认为这个片段包含有T和B抗原决定簇,这个观点与前面的研究不一致［12］。故明确Megalin的确切抗原决定簇将有助于对HN肾炎分子机制的探讨，并最终有助于人类膜性肾病的治疗。
　　1&&Megalin基因片段（）的获得
　　1.1&&材料与试剂&&清洁级SD健康成年大鼠（来源于华中科技大学同济医学院实验动物中心）、Trizon试剂（Omega Blotek公司的RNA-Solv Reagent）、氯仿、异丙醇、乙醇、DEPC处理水、手术器械、玻璃匀浆器、Pharmacia Biotech的Gene Quent RNA/DNA Calculator；逆转录酶M-MLV（MBI公司）、Rnasin Ribonuclease Inhibitor（华美生物工程公司）、dNTP（25mM混）； Roche公司的Expand Long Template PCR System、PCR仪（PERKIN ELMER公司的GeneAmp PCR System 9600）。电泳槽、100bpDNA Ladder、lambdaDNA/HindⅢ+ EcoRⅠ Markers、英国UVP公司GOS800型凝胶成像分析系统。实验引物由上海生工生物工程公司合成。P1： “5′-CGT GGA TCC CAG CAG TGT GGC TCC CTC TC&&-3′”；5′端有BamHⅠ酶切位点G↓GA TCC，酶切位点后的碱基序列开始于Megalin的3189（Megalin基因序列查自NCBI的GeneBank）。P2： “5′-GCC GGA ATT CGC AAA GTG GGG ACT CGT CAG -3′”；5′端有EcoRⅠ酶切位点G↓AA TTC。凝胶DNA回收试剂盒和小量质粒提取试剂盒（Omega公司）、BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ（TaKaRa公司）、T4 DNA Ligase（TaKaRa公司）、Lambda DNA/HindⅢ＋EcoRⅠ Markers、原核表达质粒 pTrcHis A（Invitrogen公司）、TOP 10菌种（pTrcHis A自带）。一抗6-Histidine（Epitope Tagging）Ab-1（Clone 4D11）鼠单抗（NeoMarkers公司）、二抗为碱性磷酸酶标记马抗小鼠IgG（H+L）（北京中山生物技术有限公司）、NBT/BCIP染色试剂盒（华美生物工程公司）、低分子量标准蛋白质（武汉天源公司）、醋酸纤维膜、电泳仪（BioRad）、电转仪（Biometra）。
　　1.2&&实验方法
　　1.2.1&&大鼠肾皮质总RNA提取&&SD大鼠开腹后，生理盐水灌洗肾脏，剪下肾皮质，留下100mg左右的样品；放入事先干烤过的玻璃匀浆器中，加入1ml Trizon试剂，按试剂说明书提取总RNA，最后测OD值，并计算其浓度，OD260在1.6~2.0示其纯度高；将RNA于-70℃保存。
　　1.2.2&&逆转录&&总反应体系20μl ；加入5μg RNA，依次加入引物 P2、无RNase水、M-MLV 5×buffer、dNTP、RNAsin、M-MLV，42℃温育60min后，95℃ 5min终止反应，反应产物-20℃保存。
　　1.2.3&&PCR&&按Roche公司的Expand Long Template PCR System说明书操作。在2个EP管中分别配液，mix 1包括dNTP混、P1＋P2混、逆转录模板DNA，加水至终体积25μl，mix 2包括10×buffer 3、MgCl2、长酶，也是加水至终体积25μl。mix 1、mix 2稍离心混合后，将mix 1加入到mix 2，再稍离心混合；加入30μl矿物油；立即进行PCR循环。循环条件：94℃变性2min后；进行94℃变性10s，63℃退火30s，68℃延伸45s，共10个循环；然后94℃变性10s，63℃退火30s，68℃延伸不同时间，共20个循环，延伸时间从45s开始，每个循环增加20s。最后再68℃延伸7min，4℃结束反应。
　　1.2.4&&DNA电泳&&常规制胶、点样、电泳、凝胶成像系统观察。
　　1.2.5&&DNA回收、酶切和连接&&按Omega试剂盒说明书操作。DNA电泳后，切下目的条带后，进行去凝胶，然后上DNA结合柱，最后洗脱下DNA。DNA酶切采用BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切体系。DNA的连接用T4DNA连接酶16℃反应过夜（或更长时间）。
　　1.2.6&&重组质粒DNA的鉴定&&常规细菌培养、保存，感受态细菌制备，质粒的转化用CaCl2法。质粒DNA的提取参照Omega小量提取试剂盒操作。
　　1.2.7&&融合蛋白的诱导表达&&按Invitrogen公司原核表达质粒pTrcHis A说明书操作。含重组质粒的单菌落TOP 10接种2ml LB Amp+培养基，过夜培养；第二天将过夜的菌液0.3ml接种到50ml LB培养基中（Amp+），37℃ 300r/min剧烈振摇3h取1ml菌液，离心后去上清，沉淀放在-20℃保存，标记为0点样本。再加入IPTG（终浓度为1mM），继续剧烈振摇。每隔1h取一次样本，取6次；同样离心菌液，沉淀保存-20℃，分别标记为1h样本、2h样本等。所有时间点的样本收集完后，用100μl PBS重悬沉淀；液氮冷冻、42℃水浴融解，反复冻溶数次；再用低温离心机以最大速度离心10min。分装上清和沉淀，与蛋白电泳上样缓冲液混合后电泳；考马斯亮蓝染色，寻找强度增加的期望分子量大小的蛋白条带；并与阳性和阴性对照比较。
　　1.2.8&&Western-Blot蛋白印迹检测目的融合蛋白的表达&&将诱导表达的融合蛋白（样品沉淀）与上样缓冲液混合后电泳，10mA 30min，接着25mA 90~120min。取下凝胶，与膜、滤纸叠成三明治结构，用夹子夹好，300mA电转70min。取下膜，用封闭液（TBST+5%的脱脂奶粉）封闭1~2h，TBST洗膜，10min 4次；一抗稀释的封闭液（1∶500）封闭膜，4℃过夜；TBST洗膜，10min 4次；二抗稀释的封闭液（1∶500）封闭膜1~2h；TBST洗膜，10min 4次；最后NBT＋BCIP显色，凝胶成像系统拍照分析。
　　2&&重组表达质粒（带有Megalin基因片段的pTrcHis A）的构建
　　pTrcHis A是带有N末端6×His（6个组氨酸）的可在E.coli（大肠杆菌）高效表达和纯化重组蛋白的质粒，它是pBR322来源。结构图见图1，重组质粒的构建图见图2，酶切鉴定图见图3。
　　图1－图3&&（略）
　　3&&成功获得融合蛋白的表达
& && &&&融合蛋白预期分子量为38kD（Megalin 约35kD，加上N末端的6xHis有3kD）。带重组质粒的TOP 10 经IPTG诱导后，再用Western-Blot检测得到蛋白条带位于47kD与33kD之间，与预期大小相符。不带质粒的TOP 10经诱导无蛋白条带；阳性对照TOP 10/CAT在IPTG诱导前没有条带出现，而在IPTG诱导后4h出现大小为33kD的蛋白条带。证明本实验成功获得了Megalin基因片段融合蛋白。见图4。
　　图4－图5（略）
　　4&&结果
　　RT-PCR获得大鼠肾Megalin基因片段（共1000bp），并测序。Megalin基因片段是Megalin基因第2簇配体结合区，共981个碱基（bp）；加上2个引物前的酶切位点和保护碱基（19个bp），故整个目的片段的分子大小应为1000bp。本实验利用两种不同PCR体系均获得1000bp的目的片段。为了保证PCR的忠实性，后期克隆所选择的是用Roche公司的Expand Long Template PCR System获得的目的片段。图6显示目的片段与DNA标准1000bp位置平行，大小一致（Marker是DNA100bp梯度，其中较亮的条带分子大小为500bp）。
　　图6&&融合蛋白表达图　（略）
　　5&&讨论
　　大鼠Heymann肾炎因其临床过程和病理类型与人类膜性肾病非常相似，已作为人类膜性肾病的动物模型使用40余年。其发病机制尚未完全清楚，对它的研究主要集中在探讨其免疫复合物形成的机制和免疫复合物形成后对肾小球的损伤上。对前一个问题的研究由于很早人们就发现HN是原位免疫复合物沉积，因此人们研究的方向转入寻找原位抗原及其抗原决定簇的定位，包括T细胞决定簇和B细胞决定簇。对后一个问题则事实上要探讨蛋白尿形成的原因，人们发现多种因素均可造成肾小球滤过膜的损伤，其中最重要的是补体机制的参与、攻膜复合物（C5b-9）对肾小球足细胞的损害，由此可以产生后续损伤机制的激活［13］。
　　HN抗原研究确定抗原位于肾近端小管［14］,致病的是一部分特异抗原，命名为RTEα5，是一个脂蛋白分子，存在于大鼠肾近端小管刷状缘上皮细胞胞膜中。起初人们认为用RTEα5注射大鼠可诱导出HN，尽管它不是肾小球的成分，但它也可随免疫复合物和补体一起呈颗粒状沉积在肾小球毛细血管网，因此人们认为HN的发病是由循环免疫复合物沉积在肾小球所导致的［15，16］。后来的研究很快推翻了这个观点,因为用抗体灌注孤立的肾脏，也有免疫复合物的沉积，这清楚地提示循环抗体是与肾小球固有抗原结合才形成免疫复合物的沉积［17］。但是这个固有抗原的定位研究开始并不统一，1982年Kerjaschki D和 Farquhar MG用肾洗脱IgG沉淀出HN特异抗原，显示为刷状缘胞膜上一种单一的糖蛋白，SDS-PAGE表明该分子的分子量为330kD，并以此命名为gp 330；用纯化的gp 330可以诱导aHN，其产生的抗体也可诱导pHN，而去除gp 330则不能诱导产生HN；这些充分证明gp 330是HN的致病抗原［1］。1983年他们又用免疫组化方法证实gp 330除肾小管刷状缘外，的确还定位在大鼠肾上皮细胞的胞被小凹处，从而又为HN的发病是原位免疫复合物学说提供了有力的证据［2］。同时期的Marker SP等人通过对Fx1A的生化分析、亲合层析等方法鉴定致病抗原是一分子量为600kD的糖蛋白，命名为gp 600；它也充分显示出致病的特性,直接注射大鼠可以诱导产生aHN，其抗体可以诱导产生pHN，另外Fx1A中仅gp 600可以与肾病自身抗体反应。SDS-PAGE电泳显示为5条带，分别从70~330kD，考虑是由于gp 600分子量太大，电泳时分解所致；综合Kerjaschki D的研究，Marker SP还认为gp 330是gp 600的一部分或者说gp 600是gp 330的前体［18］。1989年Raychowdhury R等人发现gp 330与人低密度脂蛋白受体具有同源性，提示gp 330属于低密度脂蛋白受体家族成员［19］。此后人们又鉴定出HN另一抗原成分，分子量为39kD，即受体相关蛋白（RAP）；因其与gp 330具有一定的同源性，故起初认为它是gp 330的一部分，后来发现它是一种独立的蛋白［20，5］。研究显示RAP是gp 330的分子伴娘，它与gp 330紧密结合在一起，形成HN抗原复合物，而导致HN的发作。对RAP抗原位点的研究现已精确定位到N末端的15个氨基酸（39-44氨基酸）。Megalin的研究显示并不是整个gp 330分子都具有致病性，因此人们致力于寻找gp 330上的致病抗原决定簇。1994年gp 330基因全长被克隆出来,确定它有4660个氨基酸，成熟分子的分子量为516kD，包括N末端信号肽、细胞外区域（4400个氨基酸）、一个穿膜区域（22个氨基酸）和C末端的胞浆尾（213个氨基酸）。细胞外区域包含三种类型富含半胱氨酸的重复序列，它们也是低密度脂蛋白受体（LDLR）基因家族的特征；即36个LDLR配体结合重复序列形成了4个潜在的受体配体结合簇，16个生长因子重复序列被8个YWTD空间区域所分隔开，还有一个C末端的上皮生长因子重复序列。胞浆尾包括2份重复的（FX）NPXY基序，它代表了胞被小凹内化的信号，另外还有一个和NPXY类似基序。gp 330整个的结构证实是低密度脂蛋白受体家族成员，且因其分子量巨大，被命名为Megalin。当然gp 330与这些低密度脂蛋白受体家族成员也存在一些不同之处，表现在：（1）半胱氨酸富集的重复序列被排列在细胞外区域N末端和C末端的顶头；（2）在YWTD空间区域半胱氨酸残基的分布方式；（3）与furin识别序列一致的RX（K/R）R的定位，而furin是处理内源性蛋白酶的前体；（4）胞浆尾的长度和结构。这些差异可能提示其独特的生理和病理作用。
　　考虑到Megalin基因胞外区的4簇胱氨酸富集区（分别含有7、8、10、11个低密度脂蛋白受体配体结合重复序列），最有可能存在潜在致病抗原决定簇。因此1996年Akihiko Saito等分别截取这4簇cDNA片段，用轮状病毒体系表达融合蛋白，再用pHN血清进行免疫沉淀，发现仅有第2簇的表达产物可以被检测到。此后，进一步截短第2簇蛋白，发现第5个配体结合重复序列（氨基酸）包含有主要的抗原决定簇［11］。同时Robert A.Orlando等［6］人通过RAP具有阻止一些配体与Megalin结合的特性，发现乳铁蛋白、抑肽酶、脂蛋白脂肪酶、RAP等与Megalin结合均分别存在于第2簇配体结合区内的同一位点，大致位置在氨基酸附近。这些现象引起大家对Megalin第2簇配体结合区的注意，Megalin的第2簇配体结合区域类似LDL受体的配体结合区域，含有8个胱氨酸富集重复序列（A类基序），每一个序列又包含一个高度保守的丝氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸序列和一个保守的6个半胱氨酸残基间隔序列，其中丝氨酸-天门冬氨酸-谷氨酸序列出现在Megalin每一A类基序的第5和第6个半胱氨酸之间，它有助于Megalin与其配体之间的相互作用（电荷依赖）。故人们认为Megalin的第2簇配体结合区域在HN发病和配体结合方面均发挥重要作用。但后来的一些研究却提出不同看法，1998年H Yamazaki等［21］人用抗Megalin 4簇基因融合蛋白分别诱导pHN，间接免疫荧光显示抗其他3簇配体结合区域的抗体与第2簇一样可出现免疫复合物的沉积；因此他们认为Megalin 4簇配体结合区均可能包含抗原决定簇。2000年Andrew V.Oleinikov等［12］又发现gp 600 N末端的一小部分约60kD的蛋白，定位在Megalin的第1簇配体结合区和第1个YWTD分隔区（Western Blot结果显示位于gp 600氨基酸180-453），可以诱导完整的aHN；故他们认为这一段蛋白才包含Megalin的T和B抗原决定簇。
　　由上可知，Megalin抗原决定簇位点的研究并不统一，本实验以Megalin基因第2簇配体结合区域为起点，运用分子克隆技术将其第二段基因（氨基酸序列998-1324）与原核表达载体pTrcHis A重组，并成功获得其融合蛋白。为下一步截短融合蛋白，确定抗原决定簇的定位以及研究其相应功能打下一定的基础。对Heymann肾炎分子免疫机制的研究，尤其是Megalin基因抗原决定簇的定位，将可根据该病理性抗原决定簇的碱基序列，人工合成较短的多肽疫苗，诱导免疫耐受或者导入体内特异性地封闭病理性抗原决定簇与循环抗体的接触，阻止免疫复合物的形成，从而为人类膜性肾病和一些自身免疫性疾病的治疗开辟一条新的途径。
　　【参考文献】
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& Comsenz Inc.在进行限制性酶切反应过程中，影响限制性酶切反应效果的因素较多，要设计酶切反应，一般均应考虑诸如酶切系统、温度条件、反应体积、底物性质及星型反应等因素。根据各种不同的条件，酶切反应的设计一般应注意以下问题：
1. 大多数限制酶贮存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃条件下结冰。当最终反应液中甘油浓度大于12％时，某些限制酶的识别特异性降低，从而产生星活性，更高浓度的甘油会抑制酶活性。因此加入反应的酶体积不超过反应总体积的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影响。（20ul体系酶量2ul是上限，如果切的底物量很大就请放大体系的体积，效果很好！！）
2. 浓缩的限制酶可在使用前用1×限制酶缓冲液稀释，但切勿用水稀释以免酶失活，用水稀释的酶不能长期保存。
3. 反应体系中Mg2+是限制酶仅有的共同因子，当用其它二价阳离子代替Mg2+或加入能螯合Mg2+的EGTA或EDTA时，酶活性会被抑制，或改变酶的特异性，导致星型反应
4. 多种因素可引发星型反应：①非最适的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶浓度大于25u/ug；④盐浓度降低；⑤高浓度甘油的存在(&12%)；⑥有机溶剂的存在。。（呵呵，所以反应是底物一定要处理干净，用ddH2O溶解最好；另：酚会严重抑制梅切！！）
5. 反应混合物中DNA底物的浓度不宜太大，小体积中过高浓度的DNA会形成粘性DNA溶液抑制酶的扩散，并降低酶活性。建议酶切反应的DNA浓度为0.1-0.4ug/ul。（比如XbaI在质粒浓度高时效果很差！！！就是切不开啦）
6. 酶切反应所加入的酶量应适中，根据底物的种类、量的多少和体积的大小而定，对不同的限制酶，各厂家均有一最大的消化量指标可参考。
7. 当要用两种或两种以上限制酶切割DNA时，如果这些酶可以在同种缓冲液中作用良好，则两种酶可同时切割，如果这些酶所要求的缓冲液有所不同，则可采用以下两种替代方法： ①先用在低离子强度的缓冲液中活性高的酶切割DNA，然后加入适量NaCl及第二种酶，继续反应；
②使用能够使多数内切酶均表现较高活性的单种缓冲液。（参看商品目录撒，看各酶在各buffer中的活性！！）
8. 用同一种酶切割不同的DNA时，所需酶量不同，可根据DNA底物上酶切位点的多少与λDNA存在位点的数目比较后，决定用酶量。对于超螺旋DNA，基因组DNA、琼脂糖包埋的DNA，使用的酶单位活性应适当加大。
9. 反应混合液中加入浓度为0.1mg/ml的BSA，可维持酶的稳定性。
10.酶切底物DNA应具备一定的纯度，其溶液中不能含有迹量酚、氯仿、乙醚，大于10mM的EDTA，去污剂SDS以及过量的盐离子浓度，否则会不同程度地影响限制酶的活性。
11.DNA碱基上的甲基化修饰也是影响酶切的一个重要因素，所以转化实验所选择的受体菌株应考虑到使用的菌株中的酶修饰系统。(haha ,这一点大家可以问veteran,他
有很深的体会！！)
12.要保证酶作用时的最佳反应条件(ph, 温度)和底物用量（并不是底物越多越好的），酶反应才能有效地进行。
13.反应取酶时应使用无菌吸头，以免污染酶液，同时应尽量缩短酶在温室的放置时间。
14.高于37℃或需长时间保温时，可加入矿物油（实验室有石蜡油！）覆盖在反应液上以减少水分蒸发。
15.反应混合物混匀时，应避免强烈振荡以保证不使内切酶变性及DNA大分子的完整（可用手轻弹或枪头吸吐！但有些酶是千万不能吸吐的，如klewnom等！！）。
16.反应前的低速离心是必要的，这可使因混匀吸附于管壁上的液滴全部沉至管底。
17.用已硅化的离心管进行酶切反应，可获得更佳的酶切效果，否则DNA可能粘附于管壁而影响酶切效果。
18.终止酶反应可根据需要采用不同的方法：①酶切后不需进行下一步反应，可加入含EDTA的终止液终止反应；②若需进一步反应(如连接，切割等)，可将反应管置65℃保温20-30分钟，以高温灭活酶终止反应。③可用酚/氯仿抽提，乙醇沉淀获得较纯DNA进行下一步酶学操作。
19. 不同厂家的试剂不可混用，需要时请查明相关条件及数据。
二、限制性酶解中常见的问题及解决措施（问题、原因及解决办法）
限制性酶切割DNA底物的操作过程中，会出现一些问题，产生的原因主要为酶解体系中各要素处于非最佳状态，包括DNA的纯度和特性，反应缓冲液、反应体积、反应时间及温度等。
A. DNA完全没有被内切酶切割
1) 内切酶失活：标准底物检测酶活性
2) DNA不纯，含有SDS，酚，EDTA等内切酶抑制因子：将DNA过柱纯化，乙醇沉淀DNA
3) 条件不适（试剂、温度）：检查反应系统是否最佳
4) DNA酶切位点上的碱基被甲基化：换用对DNA甲基化不敏感的同裂酶酶解，重新将质粒DNA转化至dcm-，dam-基因型的细菌菌株
5) DNA酶切位点上没有甲基化（如Dpn I）：换用不同切割非甲基化位点的同裂酶消化DNA（如San3A I代替Dpn I)，重新将质粒转至dcm+ dam+菌株中扩增
6) DNA位点上存在其它修饰：将DNA底物与λDAN混匀进行切割验证
7) DNA不存在该酶识别顺序：换用其它的酶切割DNA或过量酶消化进行验证
B. DNA切割不完全
1) 内切酶活性下降：用5-10倍量过量消化
2) 内切酶稀释不正确：
用酶贮藏液或反应缓冲液稀释酶
3) DNA不纯，反应条件不佳：同上
4) 内切酶识别的DNA位点上的碱基被甲基化或存在其它修饰：同上
5) 部分DNA溶液粘在管壁上：反应前离心数秒
6) 内切酶溶液粘度大，取样不准：将内切酶稀释，增大取样体积
7) 酶切后DNA粘末端退火：电泳前将样品置65℃保温5-10分钟，取出后置冰浴骤冷
8) 由于反应溶液、温度、强烈振荡使内切酶变性：使用标准反应缓冲液及温度，避免强烈振荡
9) 过度稀释使酶活性降低：适当稀释酶液，反应液稀释的酶不能贮藏
10)反应条件不适：使用最佳反应体系
11)识别位点两侧插入了可影响酶切效率的核酸顺序：加大酶量5-10倍
C. DNA片段数目多于理伦值
1) 内切酶星状活性：检查反应条件：甘油浓度大于12%，盐度过低，Mn2+的存在及酶：DNA值过大均均可导致星状活性，降低酶的用量
2) 其它内切酶污染：用λDNA作底物检查酶切结果
3) 底物中含其它DNA杂质：电泳检查DNA，换用其它酶切，纯化DNA片段
D. 酶切后没有观察到DNA片段的存在
1) DNA定量错误（如RNA含量较高）：用RNA酶A（无DNA酶）100ug/ml消化DNA样，酚抽提后沉淀溶解，定量
2) 在酶切反应液中形成非特异的沉淀：在反应前透析DNA样品或用酒精沉淀二次 E. 内切酶保存期内快速失活
1) 保存温度不合适：内切酶贮藏在含50%甘油的贮藏液中，应在-20℃低温保存
2) 以稀释形式保存：稀释酶液不宜长期存放，应一次使用
3) 贮藏缓冲液不适当：使用厂家推荐的贮藏缓冲液
4) 低蛋白浓度：内切酶与500ug/ml的BSA一起保存
F. 电泳后DNA片段的带型弥散，不均一
1) DNA上结合有蛋白质: 电泳前上样液65℃加热5min，并加入0.1%的SDS，酚/氯仿抽提纯化
2) 内切酶中含有DNA外切酶: 减少酶用量或消化时间，换用新包装的酶
G: 酶切后的DNA片段连接效率低
1) 含磷酸盐的浓度高: 透析，乙醇沉淀去除磷酸盐
2) 内切酶失活不全或含有ATP酶: 延长灭活时间或用酚抽提，乙醇沉淀回收DNA
3) 平末端连接: 加大T4 DNA Ligase用量
4) 外切酶污染: 减少酶用量，缩短保温时间，酚抽提回收DNA
5) 连接缓冲液不合适：重新配制连接缓冲液
三、DNA分子量标准问题分析（问题、原因及解决办法）
A. 带弱或无DNA带
1) 上样DNA的量不够: 增加DNA的上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高
2) DNA降解: 避免DNA的核酸酶污染
3) DNA走出凝胶: 减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
4) 对于EB染色的DNA，所用紫外光源不合适: 应用短波长（254nm），紫外灯增强灵敏度
B. DNA带缺失
1) 小DNA带走出凝胶: 减短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
2) 分子大小相近的DNA带不易分辨: 增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度
3) DNA 变性: 电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl Buffer稀释DNA
4) 巨大DNA链，凝胶电泳不合适: 在脉冲电声凝胶电泳上分析
C. DNA带模糊
1) DNA降解: 避免核酸酶污染
2) DNA上样量过多: 减少凝胶中DNA上样量
3) 所用电泳条件不合适:
电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力
4) DNA样含盐过高: 电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
5) 有蛋白污染: 电泳前酚抽提去除蛋白
6) DNA变性: 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA
D. 不规则DNA带迁移
1) 对于λ/Hind III片段COS位点复性: 电泳前加热DNA 65℃加热5-10分钟，然后在冰上冷却5分钟
2) 电泳条件不合适: 电泳电压不超过20V/cm，温度＜30℃，电泳缓冲液有足够的缓冲能力
3) DNA变性: 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热
以λ/Hind III为代表的λDNA酶切片段用作电泳分析中的分子量标准，会发现电泳后分子量条带不对的问题，解释原因如下：在Lambda DNA分子的左右臂存在着12个碱基组成的具有互补顺序的单链突出端-COS位点，COS位点的退火复性，在λDNA片段电泳分离时会出现问题，含左右臂片段在胶上应出现的地方条带会减弱或完全看不到，而复性的左右臂片段会结合成大的片段，即在较大的分子量区域内产生一个额外的条带，这就造成了不正常的带型。解决以上问题的办法，是在电泳之前，把DNA分子量标准67℃加热约10分钟，然后立即放入冰浴中骤冷，待样品冷却后上样。这样即可解离复性的粘性末端，使电泳过程DNA片段形成正常的带型分布。
四、凝胶电泳操作注意事项}