基因敲除自20世纪80年代末发展起来是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：

该技术的主要步骤及应用如下：

（1）第一步是构建打靶载体．把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中使目的基因______

（2）第二步是将打靶载体通过______技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因以达到基因敲除的目的．

（3）第三步是用选择培养基筛选靶ES细胞．用含______的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基______所有能表达HSV-TK基因的细胞（含HSV-TK基因的细胞能将无毒的GCV转化成有毒的药物）．

（4）第四步是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中再将此囊胚植入______体内，使其发育成嵌合体小鼠．嵌合体小鼠与______小鼠杂交筛选获得基因敲除小鼠．

（5）通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究______的目的；通过敲除忼原决定基因还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除______．

解：（1）第一步是构建打靶载体．把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯皰疹病毒胸苷激酶基因HSV-TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中使目的基因失活．

（2）第二步是将打靶载体通过显微注射技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因以达到基因敲除的目的．

（3）第三步是用选择培养基筛选靶ES细胞．用含新霉素的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基淘汰所有能表达HSV-TK基因的细胞（含HSV-TK基因的细胞能将无毒的GCV转化成有毒的药物）．

（4）第四步是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中再将此囊胚植入代孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠．嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交筛选获得基因敲除小鼠．

（5）通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究目的基因（敲除基因）的功能的目嘚；通过敲除抗原决定基因还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除免疫排斥反应．