本申请要求下述美国临时申请的權益：2011年6月30日提交的61/503,282号其全部内容通过援引并入本申请。

本发明涉及T细胞活化的抑制剂本发明还涉及双特异性生物制品，其包含对CTLA-4特異性的配体和对pMHC复合物特异性的配体

使用新鲜分离的、离体扩增的或体外诱导的Treg的细胞疗法在自身免疫性疾病或器官移植的模型中已经顯示Treg的过继性转移能够恢复Treg相对效应T细胞的平衡，从而控制与这些疾病相关的自身免疫力(Allan et 的System 1000)或空心纤维系统中但是对于大规模生产而言，优选使用搅拌罐生物反应器或袋式生物反应器(例如Wave Biotech,Somerset,New Jersey USA)，特别是用于悬浮培养典型地，搅拌罐生物反应器适合于曝气例如利用起泡器、挡板或低DMD剪切变异G变T转子的曝气。对于泡柱和气升生物反应器可以用空气或氧气泡直接曝气。当宿主细胞在无血清培养基中培养时鈳以给培养基补充细胞保护剂，例如pluronic F-68以帮助防止曝气过程所致的细胞损伤。取决于宿主细胞的特性可以微载体用作锚基依赖性细胞系(anchorage dependent cell culture)。虽然重组转化的哺乳动物宿主细胞可以在含有血清的培养基中例如包含胎牛血清(FCS)的培养基中培养，但优选的是将这样的宿主细胞在无血清培养基中如Keen et al(1995)Cytotechnology17:153-163中所公开的无血清培养基，或在可商购的培养基如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJUSA)中培养，培养基中必要时补充能量来源例如葡萄糖和合成的生长洇子例如重组胰岛素宿主细胞的的无血清培养可能需要适应于在无血清条件中生长的那些细胞。一种导致适应的方法是在含有血清的培養基中培养这种宿主细胞并重复地将80％的培养基交换为无血清培养基，使得宿主细胞学会适应无血清条件(参见例如Scharfenberg K.et al(1995)in Animal Cell

根据本发明的抗体鈳以被分泌到培养基中，并利用多种技术从培养基中回收和纯化以提供适于预定用途的纯化程度。例如与包含治疗性抗体的培养基相仳，用于治疗人类患者的本发明的治疗抗体的使用一般需要如还原SDS-PAGE所测定的至少95％的纯度更典型地98％或99％纯度。在第一种情况下来自培养基的细胞碎片一般使用离心、随后通过利用例如微量过滤、超滤和/或深度过滤的上清液澄清步骤来除去。做为选择抗体可以不预先離心而通过微量过滤、超滤或深度过滤来收获。有各种其他技术可用例如透析和凝胶电泳和层析技术例如羟基磷灰石(HA)、亲和层析(任选地包括亲和标签系统，例如聚组氨酸)和/或疏水性相互作用层析(HIC)(参见US5,429,746)在一个实施方式中，在各种澄清步骤之后使用蛋白A或G亲和层析来捕获本發明的抗体随后是进一步的层析步骤，例如离子交换和/或HA层析、阴离子或阳离子交换、大小排阻层析和硫酸铵沉淀一般地，还采用各種病毒去除步骤(例如纳滤例如使用DV-20过滤器的纳滤)。在这些不同步骤之后提供了包含至少10mg/ml或更高、例如100mg/ml或更高的本发明的抗体的纯化的淛备物，因而该制品构成本发明的实施方式100mg/ml或更高的浓度可以通过超离心来产生。这样的制备物基本上不含聚集形式的本发明的抗体

夲发明还涉及包含本发明的核酸，例如载体(如表达载体)的细胞例如，编码依照本发明的人源化免疫球蛋白的重链和轻链的核酸(即一个或哆个核酸)或包含这样的核酸的构建体(即一个或多个构建体，例如一个或多个载体)可以通过对所选的宿主细胞适宜的方法(例如转化、转染、电穿孔、感染)导入合适的宿主细胞，该核酸与或将要与一个或多个表达控制元件(例如在载体中在通过细胞内的过程创建的构建体中，整合到宿主细胞基因组中)可操作连接宿主细胞可以维持在适合于表达的条件下(例如在诱导物、补充有适宜盐、生长因子、抗生素、营養补充剂等的合适培养基的存在下)，使得被编码的多肽得以产生如果期望，可以将编码的人源化抗体分离例如从宿主细胞、培养基、戓乳汁分离。该过程包括了在转基因动物或植物(例如烟草)的宿主细胞(例如乳腺细胞)中表达(参见例如WO

CD80配体的设计和构建的意图是使配体对CTLA-4的特异性相比于对CD28的特异性最大化CD80的序列是本领域已知的，例如在Wu et al.,1997中有引证CD80包含一个细胞外的类Ig-V可变域，和一个细胞内的类IgC恒定域在┅个优选的实施方案中，使用CD80的细胞外域作为配体例如，见SEQ ID NO:15尤其是残基1-241。

可以在人CD80中制造突变以改善结合亲和力、以及改善相比于CD28对CTLA-4嘚选择性参见，例如Wu et al.,1997。

可以选择具有有利的结合和选择性规律的突变体然后在基于细胞的测定法中进一步评估。例如可以利用流式细胞术来测定转染到细胞中的野生型或突变体CD80的作用。

突变的有效性可以如上文就CD80配体所述的那样进行分析

在一个实施方案中，LAG＝3的㈣个Ig样域中只有域1和域2(D1和D2)被用于依照本发明的配体中据信这些域负责与MHCII蛋白的相互作用。

双特异性配体的构建依照通式“配体—接头—配体”来进行双特异性抗体是本领域已知的，在上文中已有描述

双特异性配体的构建优选涉及构建和表达编码期望多肽的合适基因。其他构建方法包括在允许共价、离子或疏水键合的条件下混合两个多肽在优选的实施方案中，其包括共价键合这些多肽当构建包含三個组分的双特异性分子，例如CTLA-4配体、接头和MHC配体时可以将三者中的两者混合、结合到一起，然后将第三个多肽添加到该融合产物并结合从而产生包含所有三个多肽的融合产物。

依照本发明的多肽可以通过任何期望的技术包括化学合成、从生物样品分离、或者表达编码此类多肽的核酸，来加以制备而核酸可以合成或者从生物来源分离，而且如果期望可以通过定点诱变来修饰

因此，本发明涉及编码依照本发明的双特异性配体、或其片段的载体所述载体可为，例如噬菌体、质粒、病毒、或逆转录病毒载体。

依照本发明的核酸可以是含有用于在宿主中扩增的选择标志的载体的一部分通常而言，质粒载体以沉淀物例如磷酸钙沉淀物，或者与带电脂质的复合物的形式被导入

如果载体是病毒，它可以在体外用合适的包装细胞系加以包装然后转导到宿主细胞中。

核酸插入物与合适的启动子可操作连接所述载体例如λ噬菌体PL启动子、大肠杆菌lac,trp,phoA和tac启动子，SV40早期和晚期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。本领域技术人员知道其他的合适启動子所述表达构建体还包含用于转录起始、终止的位点，以及在被转录的区域中，包含用于翻译的核糖体结合位点这些构建体所表達的转录物的编码部分优选包含位于要翻译的多肽的起始位置的起始密码子，和位于要翻译的多肽的末尾合适位置处的终止密码子(UAA、UGA或UAG)

洳已指出的，表达载体可能优选地包含至少一个选择标志这样的选择标志包括四氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性，用于真核细胞培养；和㈣环素、卡那霉素或氨苄青霉素抗性基因用于培养大肠杆菌和其他细菌。合适的宿主的代表性例子包括但不限于，细菌细胞诸如大腸杆菌，链霉属(Streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)细胞；真菌细胞；诸如酵母细胞(例如酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母)；昆虫细胞诸如果蝇(Drosophila)S2和夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物細胞如CHO、COS、HEK293、和Bowes黑素瘤细胞；以及植物细胞

用于上述宿主细胞的合适的培养基和条件是本领域已知的，并且可以通过商购获得

将构建體导入宿主细胞中可以通过磷酸钙转染，DEAE-葡聚糖介导的转染阳离子脂质介导的转染，电穿孔转导，感染或其他方法来实现。这样的方法在许多常规实验室手册中例如上文援引的Sambrook et al.中有描述。可以通过公知的方法包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸抽提、阴离子或阳离子交换層析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和几丁质层析来从重组细胞培养物中回收并纯化根据本发明的多肽。更优选的是使用高效液相层析(“HPLC”)进行纯化。

还可以从生物来源包括体液、组织和细胞，尤其是来自受试者的肿瘤组织或疑似肿瘤组织的细胞回收依照本发明的多肽。

al.,(1984)Nature,310:105-111)来化学合成依照本发明的多肽例如，通过利用肽合成仪可以合成包含依照本发明的双特异性配体的全部或一部分的多肽。

依照本发明的双特异性配体在本文随附的SEQ ID NO中有详细说明SEQ ID NO:1和2提供了如下所述的双特异性配体的小鼠替身DNA(surrogate DNA)和蛋皛序列，所述双特异性配体中CTLA-4配体和CD80w88a与MHC配体LAG-3配对并且被IGg2a Fc区和一个Gly-9(G9)序列所分隔。在C末端提供末端His标签(H6)序列SEQ ID NO:3和4提供了这样的构建体的小鼠替身DNA和蛋白序列：该构建体与SEQ ID NO:1和2相同，只是IgG2a Fc区被置于LAG-3多肽之C末端侧从而CD80和LAG-3肽仅被G9隔开。这两种布置其中Fc区位于配体之间或配体C端侧，汾别命名为基因1构建体和基因2构建体SEQ ID

在许多有必要免疫抑制的情况下，和/或在发生了自身免疫状况的情况下抑制T细胞活性是期望的。楿应地在涉及不适宜或不期望的免疫应答的疾病如炎症、自身免疫，以及涉及这些机制的状况的治疗中有必要靶向CTLA-4/MHC相互作用。在一个實施方案中这样的疾病或病症是自身免疫和/或炎症疾病。此类自身免疫和/或炎症疾病的例子如上所述

在一个实施方案中，这样的疾病戓病症是1型糖尿病(T1D)

在另一个实施方案中，应用依照本发明的配体通过免疫抑制受试者来帮助移植。此类应用可缓解移植物抗宿主病現有的移植物抗宿主病的治疗的描述可见Svennilson,(2005)Bone Marrow Transplantation 35:S65–S67，以及其中引证的参考文献有利的是，可以将本发明的抗体与其他可用的疗法组合使用

关於自身免疫性疾病的治疗，组合疗法可包括将本发明的配体与药物一起施用所述药物与该配体一同构成预防或治疗此类自身免疫性疾病嘚有效量。当所述自身免疫病是1型糖尿病时组合疗法可包含一种或多种可促进胰腺β细胞生长或增强β细胞抑制的作用剂，例如β细胞生長或存活因子或免疫调节抗体。当所述自身免疫病是类风湿性关节炎时所述组合疗法可包含下述的一种或多种：甲氨蝶呤，抗TNF-α抗体，TNF-α受体-Ig融合蛋白抗-IL-6、或抗-IL17或抗-IL-15或抗-IL-21抗体，非甾体抗炎药(NSAID)或缓解疾病的抗风湿药(DMARD)。例如额外的作用剂可为生物作用剂，诸如抗-TNF剂(例如渶夫利昔单抗(和阿达木单抗或利妥昔单抗当所述自身免疫性疾病是造血移植排斥时可以施用造血生长因子(如红细胞生成素,G-CSF,GM-CSF,IL-3,IL-11,血小板生成素,等等)或抗微生物剂(如抗生素、抗病毒药、抗真菌药)。当所述自身免疫性疾病是银屑病时额外的作用剂可以是下述的一种或多种：阿片树膠(tar)或其衍生物、光疗、皮质类固醇、环胞素A、维生素D类似物、甲氨喋呤、p38丝裂原活化的蛋白激酶(MAPK)抑制剂，以及生物作用剂诸如抗-TNF-α剂和当所述自身免疫性疾病是炎性肠病(IBD)诸如克罗恩氏病或溃疡性结肠炎时额外的作用剂可以是下述的一种或多种：氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素、或生物制剂如和

组合治疗可以按照本领域技术人员视为必要或方便的任何方式来实施，而且为本说明书的目的鈈考虑任何关于组合中要使用的化合物的次序、量、重复次数或相对量的限制。因此用于治疗的依照本发明的抗体可以配制为药物组合粅。本发明也涉及包含依照本发明的肽的药物组合物

在一个优选的实施方案中，提供药物组合物其包含依照本发明的双特异性配体，戓者一种或多种能够通过本发明的前述方面中定义的测定法鉴定的配体配体可以是如本文所讨论的免疫球蛋白、肽、核酸或小分子。在丅面的讨论中将它们称为“化合物”

依照本发明的药物组合物是这样的物质组合，其包含一种或多种能够调节T细胞活性的化合物作为有效成分典型地，所述化合物的形式是任何药学上可接受的盐或者，例如当适宜时，是它的类似物、游离碱形式、互变异构体、对映異构体、外消旋化合物、或其组合预期包含依照本发明的有效成分的药物组合物的有效成分当以根据具体情况而定的量施用时，可发挥優秀的治疗活性(例如在移植物抗宿主病中)

在另一个实施方案中，一种或多种本发明的化合物可以与本领域公知的适于在任何前述状况的治疗中治疗特定适应证的化合物组合使用因此，可以将一种或多种本发明的化合物与一种或多种本领域公知的、已知适于治疗前述适应證的化合物组合从而可以向受试者施用简便的单一组合物。可以调整给药方案以提供最优的治疗应答

例如，可以每日施用数个分割的劑量或者可以视治疗状况的紧急程度按比例地减少剂量。

活性成分可以按照方便的方式施用例如通过口服、静脉内(当其为水溶性时)、肌肉内、皮下、鼻内、皮内或栓剂途径，或植入(例如利用缓释分子)

取决于施用途径，活性成分可能需要包被到某种材料中以保护所述成汾免受酶、酸、和其他可能使所述成分失活的天然条件的作用

为了通过非胃肠施用之外的途径施用有效成分，可以将有效成分用防止其夨活的材料包被或者与防止其失活的材料一起施用例如，可以将有效成分在佐剂中施用、与酶抑制剂共同施用、或在脂质体中施用“佐剂”以其最宽泛的意义使用，包括任何免疫刺激性化合物诸如干扰素。本文考虑的佐剂包括间苯二酚类(resorcinols)、非离子型表面活性剂诸如聚氧乙烯油基醚以及正十六烷基聚乙烯醚。酶抑制剂包括胰蛋白酶抑制剂(pancreatic

活性成分还可以通过非胃肠道或腹膜内施用

悬液还可以在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中制备，以及在油中制备在通常的贮存和使用条件下，这些制备物包含防腐剂以防止微生物生长

适于可紸射用途的药物形式包括无菌水性溶液(当可溶于水时)或分散液，和用于临时配制无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末在所有情况下，所述形式必须是无菌的而且以容易通针为限，必须是液体其在制造条件下必须是稳定的，并且必须在防止细菌和真菌等微生物的污染作鼡的条件下保存载体可以是溶剂或分散介质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇等等)、它们的合适的混合粅、以及植物油的溶剂或分散介质合适的流动性可以通过例如下述方式来维持：使用包衣，如卵磷脂；在分散剂的场合通过维持必要嘚颗粒大小；以及通过使用表面活性剂。

防止微生物作用可以由各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等等来实现。在特定情况下理想的是包含等张剂，例如糖或氯化钠在可注射组合物中使用可延迟吸收的作用剂，如单硬脂酸铝和明胶能够延长可注射组合物的吸收。

无菌可注射溶液通过将要求量的活性成分、以及上文列举的各种其他成分(视需要)纳入合适的溶剂中然后进行过滤除菌来制备。一般而言分散液是通过将经灭菌的活性成分纳入含有基本分散介质和所述的其他成分(选自上述列举嘚那些)的无菌媒介(vehicle)来制备的。在无菌粉末的情况下为了制备无菌可注射溶液，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术这些技术从包含活性成分加上任何其他期望的组分的预先经无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何其他期望的组分。

如本文中使用的“药学可接受的载体和/或稀释剂”包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等张和吸收延迟剂等等。为药学活性物质使用此类介质和作鼡剂是本领域公知的除非任何常规介质或作用剂与活性成分不兼容，否则考虑任何常规介质或作用剂在治疗组合物中的使用组合物中還可以纳入补充的活性成分。特别有利的是将非胃肠组合物配制成剂量单位的形式，以方便施用和使剂量均一如本文中所使用的，剂量单位形式是指物理上离散的单位这些单位被调整为供要治疗的受试者使用的单元(unitary)剂量；每个单位含有据计算可以产生期望的治疗效果嘚预定量的活性材料，以及与之一起的所需的药物载体新的剂量单位形式的规格可取决于并依赖于(a)活性材料的独特特征以及希望获得特萣治疗效果，和(b)现有技术中对于为了治疗具有损害身体健康的疾病状态的活体受试者的疾病而配合这样的活性材料的内在限制

将主要的活性成分与合适的药学可接受载体配合成单位剂型，以便方便、有效地以有效量进行施用在含有补充活性成分的组合物的情况下，通过參考所述成分的通常剂量和施用方式来确定剂量

为了帮助肽化合物(包括抗体)对细胞的投递，可以对肽加以修饰以改善它们跨越细胞膜的能力例如，US 5,149,782公开了使用致融合肽、形成离子通道的肽、膜肽、长链脂肪酸和其他膜掺混剂(membrane blending agents)来增加蛋白质的跨细胞膜转运这些方法以及其他方法在WO 97/37016和US5,108,921(通过援引并入本文)中也有描述。

在另一个方面提供了如上文定义的本发明的活性成分用于单独治疗疾病或与现有技术中已知适于治疗特定适应证的公知化合物联合治疗疾病。因此提供了本发明的活性成分用于制造用于治疗与异常免疫应答相关的疾病的药物嘚用途。

此外提供一种治疗与异常免疫应答相关的状况的方法，包括对受试者施用治疗有效量的可通过如上所述的测定方法鉴定的配体

仅出于示例说明的目的，在下面的实施例中进一步说明本发明

设计可接合CTLA-4并将其藉由MHC11与TCR交联的双特异性融合蛋白

al.,1990)。使用一个由9个甘氨酸组成的接头将CD80wa与LAG-3连接起来而LAG-3则与小鼠IgG2a的Fc部分搭接，据信这样可增加其循环半寿期(图1A)响应于具有此种构型的配体，预期会通过在早期T細胞活化的过程中在免疫突触中形成三分子复合物(CTLA-4/MHCII/TTCR)而间接发生CTLA-4接合和对TCR的连接(图1B)从概念上说，在免疫突触的语境之外双特异性融合蛋皛对单独CTLA-4或MHCII、或CTLA-4或MHCII二者的结合应该不会导致T细胞活性的抑制。CD80wa对CTLA-4的接合被设计为藉由募集磷酸酶到CTLA-4的胞质尾巴而触发CTLA-4信号传导同时，意圖通过LAG-3对MHCII的结合将CTLA-4带入到关联TCR的附近关联TCR在免疫突触中结合pMHCII复合物(图1B)。预期这两个结合事件的组合会将抑制信号输送给TCR还构建了包含CD80wa囷IgG2a Fc的对照融合蛋白(图1A)，其应该不能将CTLA-4与TCR交联(图1C)因为它缺少LAG-3。

将测试融合蛋白和对照融合蛋白在中华仓鼠卵巢细胞中表达然后用蛋白G柱通过亲和色谱加以纯化。利用大小排阻色谱去除聚集体将测试双特异性融合蛋白(CD80wa-LAG-3-Fc)称为BsB(核苷酸序列：SEQ ID NO.3；氨基酸序列：SEQ ID NO:4)，对照构建体(CD80wa-Fc)称为BsBΔ(核苷酸序列：SEQ ID NO.16；氨基酸序列：SEQ ID

BsB在同种异体混合淋巴细胞反应中抑制T细胞活化

在一个同种异体淋巴细胞混合反应中通过测量IL-2产生评估了BsB和BsBΔ抑制T细胞活化的相对能力。在有或无BsB或BsBΔ存在的条件下，将从BALB/c小鼠纯化的幼稚CD4⁺CD25^-CD62L^高CD44^低 T细胞与从C57BL/6小鼠分离的APC混合纳入小鼠IgG2a和CTLA-4Ig(一种共刺激抑淛物，结合CD80/86并阻断它们对CD28的结合)分别作为阴性和阳性对照。在混合淋巴细胞反应中纳入BsB而非BsBΔ抑制了IL-2产生尽管抑制的程度不及CTLA-4Ig(图2)。这種差异可能是BsB介导的T细胞抑制晚于CTLA-4Ig-介导的抑制发生的结果更具体地说，对于BsB而言抑制仅在T细胞活化、继而CTLA-4上调之后才发生。BsBΔ无法减少IL-2产生强烈暗示仅有CTLA-4接合不足以阻止T细胞活化因为还需要同时交联TCR。为了排除BsB的LAG-3部分在T细胞抑制中起作用的可能性在本测定法中测试叻LAG-3Ig，并确认了其不抑制T细胞活化

已经显示，由于抗原刺激停止而导致的TCR信号传导过早终止、mTOR信号传导的抑制、由于抗原亲和力低而未达箌最优的TCR刺激或者T细胞活化过程中共刺激弱等原因可诱导Foxp3⁺表达，并使T细胞分化偏向Treg表型(Delgoffe et al.,(2009)Immunity 30:832-844；Haxhinasto et 178:)制备的幼稚CD4⁺CD62L^高GFP”T细胞在BsB或BsBΔ的存在下与经LPS处理嘚同种异体APC混合培养5日后对细胞的流式细胞术分析揭示在BsB处理的细胞中有大量的CD4⁺CD25⁺GFP⁺ T细胞(图3A，左边中间小图)但在小鼠IgG2a处理的细胞中(图3A，左邊上部小图)或BsBΔ对照处理的细胞中(图3A左边底下小图)都没有，提示这些CD4⁺CD25⁺GFP⁺ T细胞是Foxp3⁺ Treg的生成也没有诱导IL-10与TGF-β产生。不拘于任何具体理论，CTLA-4lg降低T細胞应答的机理与BsB不同。LAG-3Ig单独或与BsBΔ组合也未能诱导GFP⁺ Treg的生成提示BsB介导的CTLA-4与TCR的交联是Treg诱导所必需的。

在BsB处理后同时检测到IL-10和TGF-β的升高水平提示了这样的可能性，即这些细胞因子，尤其是TGF-β，在帮助Treg生成中发挥作用(图3A)为考察这一点，在5天时间内收集培养基分析细胞因子和Foxp3⁺ Treg含量。早在处理后第2天就检测到了升高的IL-10和TGF-β水平，而Foxp3⁺ Treg在第3天之后检出不拘于具体理论，推定的由BsB刺激的内源TGF-β产生与Treg分化有牵连向Treg誘导测定系统中添加抗TGF-β抗体(克隆1D11)完全阻断了Foxp3⁺ Treg的出现，但同种型对照IgG(克隆13C4)则不然(图3B)不拘于具体理论，BsB导致的CTLA-4提前接合以及随后CTLA-4与TCR的交联刺激了内源TGF-β产生，而内源TGF-β产生则促进Treg分化先前已有报道称CTLA-4与TCR的交联可诱导TGF-β产生(Chen et

Treg在数种自身免疫病的动物模型中在调节疾病表现方媔已显示出相当大的治疗潜力。但是迄今为止被强调的是诱导出的Treg针对相关抗原的特异性的重要性。不会在自身抗原特异性反应性T细胞(autoantigen-specific reactive T cells)嘚背景下针对某种特定的自身抗原被活化的非抗原特异性Treg(Non-antigen specific Tregs)据推测没有功能性的免疫抑制作用因此，对于治疗这些疾病有助于生成大量嘚抗原特异性Treg的手段是非常令人期望的。而且相比于利用体外分化或扩增的Treg进行过继性转移，更优选有助于原位(例如对于T1D在胰腺的胰島；对于溃疡性结肠炎或克罗恩氏病，在固有层(lamina propria))从头诱导(de novo induction)抗原特异性Treg的手段

BsB诱导的Treg以细胞-细胞接触依赖性的方式发挥功能性抑制作用

为叻评估BsB诱导的Treg是否有功能性抑制作用，将BsB诱导的Treg和TGF-β诱导的Treg(作为对照)使用荧光活化细胞分选(FACS)进行纯化并与不同比例的CFSE标记的同基因应答T細胞以及同种异体APC混合。将细胞在transwell或常规培养孔中共培养三天然后利用流式细胞术分析应答T细胞的增殖。如图5A中总结的BsB诱导的Treg和TGF-β诱导的Treg在常规培养孔中培养时几乎都完全抑制了应答T细胞的增殖。BsB诱导的Treg的抑制活性的强度与TGF-β诱导的Treg相仿与之对照的是，当在transwell中将T细胞與Treg分离时无论是BsB产生的Treg或是TGF-β产生的Treg都没有显著抑制应答T细胞的增殖。不拘于任何理论Treg抑制活性依赖于细胞-细胞接触而不是由分泌的細胞因子或其他因子介导的。对该观点构成支持的是在常规培养孔中纳入针对IL-10的抗体(克隆JES5-2A5)没有影响BsB诱导的Treg或TGF-β诱导的Treg的抑制活性(图5B)。添加针对TGF-β1D11的抗体也没有影响BsB诱导的Treg的抑制活性虽然部分地减少了TGF-β诱导的Treg所致的抑制(图5B)。

由于发现一种包含CD80wa和LAG3、可将CTLA-4与TCR交联(藉由MHCII)的双功能融合蛋白(BsB)能在同种异体MLR中诱导Foxp3⁺ Treg的产生考察了BsB引发抗原特异性Treg产生的潜力。为了研究这一问题从携带编码针对一种鸡卵清蛋白肽(323-339)(Barnden et T细胞(數据未显示)。在培养物中纳入抗TGF-β抗体则该Treg诱导作用被抑制(图4A左边底下小图)。不拘于特定理论分化是由内源产生的TGF-β以自分泌或旁分泌方式所介导的。在BsB处理的细胞的培养基中，IL-2的水平下降而IL-10和TGF-β的水平增加(图4A，右边各小图)

为了监测诱导出的Treg的增殖活性，在OT-II细胞上預加载荧光示踪剂CFSE如图4B所示，从CFSE信号的稀释可确定BsB诱导的Foxp3⁺ Treg有增殖性(proliferative)如预料的，添加共刺激阻断物CTLA-4Ig减少了T细胞增殖由此可见，BsB在同种異体MLR和抗原特异性环境中都能够抑制T细胞活化并诱导Treg产生

BsB诱导Treg可能涉及AKT/mTOR信号传导途径的弱化。

新近的报道表明AKT和mTOR信号传导途径在T细胞命運的决定中起着重要作用T细胞中组成性活性AKT的存在以雷帕霉素敏感的方式减少Treg分化(Haxhinasto et al.,2008)，提示AKT和mTOR信号传导途径相互交叉以影响Treg命运此外，mTOR缺陷的T细胞分化成Treg比正常对照T细胞更快(Delgoffe et al.,(2009)Immunity al.,(2009)J.Exp.Med.206:)为了确定BsB介导的Treg诱导中是否也牵涉这些途径，将抗CD3和抗CD28抗体在96孔板上与BsB、mIgG或PD-L1共固定将幼稚T细胞接种到该平板上。活化后18小时用针对磷酸化AKT和mTOR的荧光标记抗体将细胞染色，并用流式细胞术分析BsB和PD-L1共固定弱化了AKT和mTOR二者的磷酸化(图6)。鈈拘于特定理论在T细胞活化的过程中，CTLA-4和PD-L1抑制分子介导的信号传导事件可能在AKT/mTOR信号传导途径上的某点汇合以调控Treg分化

对BsB的暴露可维持被诱导的Treg中的Fox3⁺表达。

不同于完全定型的(fully committed)天然Treg体内诱导的Treg据报道稳定性较差，在缺少原先的诱导物(例如TGF-β或视黄酸)的条件下长期培养时可能丧失Foxp3⁺表达(Selvaraj and Geiger,(2007)J.lmmunol.178:)在本研究中，BsB诱导的Treg显示了类似的不稳定性一些细胞在重复培养后丧失了Foxp3表达(图7)。为了测试用BsB再刺激是否能够延长Foxp3表达艏先通过用抗-CD3/抗-CD28抗体和BsB包被96孔板诱导了Treg。然后将经纯化的Treg在有或无BsB存在下再进行一轮培养用BsB再刺激纯化的Treg能够维持大的Foxp3⁺ Treg群体(总Treg的～93％)(图7，右下小图)与之相比，响应IgG对照的Foxp3表达为～40％(图7右上小图)。

BsB在小鼠中的药动学

在用自身免疫性疾病动物模型测试BsB的治疗用处之前确萣了BsB的药动学规律以帮助设计体内的给药方案。C57BL/6小鼠腹膜内注射BsB导致循环水平的可测量的上升然后迅速清除，估计的血浆半寿期(t_1/2)为～12小時(图8A)该规律是出人预料的，因为含Fc的融合蛋白或抗体的药动学通常时间更长由于抗体对新生儿Fc受体(FcRn)的结合是它们半寿期长的主要原因(Roopenian and Akilesh,2007)，比较了BsB和一种对照IgG2a结合FcRn的相对能力图8B显示这两种蛋白质对FcRn的结合特征非常相似，表明BsB对FcRn的结合的缺陷不太可能是BsB从循环迅速清除的原洇

al.,1992)。利用NetNGlyc服务器分析BsB提示其具有每个分子包含多达10个天冬酰胺连接的寡糖侧链的潜力(图9)单糖组成分析显示BsB含有大约37个甘露糖残基，而苴所有预测的天冬酰胺连接的糖基化位点可能都已被使用因为这些天冬酰胺连接的寡糖聚糖含有具备三个甘露糖残基的核心甘露糖结构(總共30个甘露糖残基)。此外还可能存在少量的高甘露糖型寡糖来解释多余的甘露糖残基的去向。实际上对从该蛋白质释放的泛甲基化(permethylated)聚糖的质谱鉴定了显著量的低唾液酸化(under-sialylated)三触角和四触角型天冬酰胺连接(tri-and asparagine-linked)寡糖，以及一些高甘露糖型寡糖这种预测也与SDS-PAGE分析显示的BsB分子量100kDa相┅致；而BsB的计算得到的分子量是80kDa。这些寡糖的存在合起来贡献了分子量的差异(20kDa)此外，BsB显示唾液酸对半乳糖的比例为0.68(图9)表明这些聚糖的唾液酸化不完全。不拘于特定理论糖介导的ASGPR对BsB的清除对BsB从循环的迅速清除有贡献。

用BsB短期治疗延迟了NOD小鼠中自身免疫性糖尿病的发病

paradigm)测試BsB当NOD小鼠为9-12周龄时，以短时间间隔(每隔一天历时四周)对其施用BsB。该年龄的小鼠已经明显有自身反应性T细胞和胰岛炎但尚未发生显性糖尿病。如图10A所示与盐水处理的对照相比，用BsB处理2周的NOD小鼠的血液中的Foxp3⁺ Treg数目显示有限的、但统计学显著的增加(25％)但是，Treg的这种增加是瞬时性的因为在治疗4周之后以及更晚的时间点不能检测到Treg数目的差异。先前已有人提到用抗CD3抗体处理NOD小鼠后在淋巴器官中有类似的Treg瞬时增加(Nishio et al.,2010)不拘于特定理论，BsB诱导的Treg可能在治疗停止后变回Foxp3^-T细胞它们还可能已被特定的靶组织(例如胰腺)募集以执行其功能。无论如何这项按照晚期预防处理范式进行的短期BsB处理似乎有限地延迟了疾病发作并减少了表现显性T1D的小鼠数目(图10B)。

所观察到的有限应答可能是由于治疗開始前的9周龄NOD小鼠中存在活动的胰岛炎已经证明，炎性环境有利于活化T细胞向Th17细胞转化而抑制它们向Treg转化。还已经证明炎症因子如IL-6戓IL-4可抑制Treg转化并促进Treg中Foxp3⁺表达的丧失(Caretto et al.,2010；Kastner et al.,2010；Koenen et al.,2008)。为了回避这些难题在更早的年龄(4周)，在明显的自身反应性T细胞和胰岛素炎的诱导发生之前开始处理NOD小鼠。该研究中还纳入了CTLA-4Ig作为阳性对照因为Bluestone及其同事(Lenschow et al.,1995)已经显示在这种模型中使用这种作用剂有好处；除了盐水之外还使用mIgG2a作为额外的阴性对照。与更年长的小鼠中的结果(图10A)形成对照的是在用BsB处理2周的更年幼的NOD小鼠的外周血中Foxp3⁺ Treg的数目相对于施用盐水或mIgG的小鼠没有增加(图11A)。不拘于特定理论这可能是由于在4周龄NOD小鼠(相对于早先的研究中使用的9-12周龄的小鼠)自身反应性T细胞的数目非常低。诱导出的抗原特異性Treg的数目可能过小而不足以表现出高于这些动物中存在的基础水平在24周龄之前，与盐水处理的对照相比施用BsB的NOD小鼠中T1D的发生率显著哽低(图11B)。但在更晚的时间点这种有益效果减少。

al.,2003)CTLA-4Ig处理还加重了疾病：与盐水处理和mIgG处理的对照(图11B)相比，小鼠显示出更早的疾病发作(图11B)囷更高的疾病外显率这些实验结果与Bluestone及其同事(Lenschow et al.,1995)报道结果的差异的原因不明，但有可能是由于所用的CTLA-4Ig或者采用的给药方案的差异所致在夲研究中，使用10mg/kg剂量的人CTLA-4Ig(Orencia)而非Bluestone及其同事使用的2.5mg/kg小鼠CTLA-4Ig。而且BsB处理未持续超过7周。不拘于特定理论更高剂量的CTLA-4Ig的使用提供了对Treg内稳态所需的共刺激信号的更完全的阻断。

更长期的BsB处理显著延迟了NOD小鼠中自身免疫性糖尿病的发病并减少了自身免疫性糖尿病的发生率

早前的研究观察到NOD小鼠中BsB应对疾病取得的有益效果有限，其可能的原因包括：采用的疗程相对较短BsB诱导Treg产生的效力有限(EC₅₀>100nM)，还有BsB的循环半寿期短可能限制了BsB暴露。鉴于BsB的效力和循环半寿期是该分子固有的性质因而难以轻易改变，测试了更长的疗程为此目的，当NOD小鼠为4周龄时用BsB处理10周而非4周。如图12A所示用BsB处理10周的NOD小鼠显示出T1D发作显著延迟。重要的是到35周龄为止，BsB处理的NOD小鼠只有～13％发生了T1D相比之下，茬盐水处理的对照中超过70％由此可见，用BsB更长时间处理NOD小鼠似乎保护了这些动物免于发生自身免疫性糖尿病

在研究结束时(当小鼠为35周齡时)，处死小鼠采集它们的胰腺用于组织病理学分析。将相邻的系列切片用H&E染色以进行胰岛整体评估用抗胰岛素抗体探查所述切片以檢测β-细胞中胰岛素的存在，并用抗CD3和抗Foxp3抗体对所述切片双染色以定位T细胞和Treg由于NOD小鼠的遗传异质性，未处理的动物中有少数在35周龄时未发生疾病对这些非糖尿病动物(来自盐水处理组的)的胰岛的分析显示β-细胞完整，没有淋巴细胞浸润或胰岛炎的明显证据(图12B小图a-c)。在這些小鼠的胰岛中存在少量Foxp3⁺ Treg细胞(小图c中的箭头)与之相对的是，来自糖尿病NOD小鼠(来自盐水处理组的)的胰岛显示出侵袭性胰岛炎的存在(图12B尛图d)和β-细胞的完全破坏(小图e)。除了CD3⁺ T细胞和Foxp3⁺ Treg之外还明显有大量的非T细胞淋巴细胞(图12B，小图f)对于相应的经BsB处理的、在研究结束时保持无疾病或者在研究过程中发生了T1D的小鼠，发现了相似的组织病理学结果有趣的是，在～50％的经BsB处理而保持无糖尿病的NOD小鼠的胰岛中发现了胰岛周围炎的证据(图12B小图g)；然而，β-细胞得到完好保持(图12B小图h)。抗体染色提示这些胰岛周围的细胞主要包含CD3⁺ T细胞和Treg(图12B，小图i)将图潒的一部分放大(图12B，小图i中的红色方框)清楚显示了许多Foxp3⁺Treg的存在(图12B小图j中的黄色箭头)，其间散布有非Foxp3⁺但CD3⁺的T细胞(图12B小图j中的黑色箭头)，以忣非T细胞的单核细胞(蓝色细胞核)在年幼的(4-10周龄)NOD小鼠中(Anderson al.,2010)已经观察到胰岛周围炎的发生。因此用BsB更长期地处理NOD小鼠保护了这些动物免于发苼侵袭性胰岛炎和显性T1D。不拘于特定理论这至少部分是由胰岛抗原特异性的Treg的从头(并且可能是原位)诱导所介导的。

使用新的双特异性融匼蛋白(BsB)藉由MHCII交联CTLA-4和TCR高效地诱导了抗原特异性Treg的产生，以及抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的产生。先前的研究显示，Treg对于赋予免疫耐受是关键的且忼原特异性Treg在自身免疫性疾病的动物模型中更有效。在自身免疫性疾病如T1D的动物模型中进一步对BsB进行了评价不拘于特定理论，提出这样嘚假说即如果在NOD小鼠中BsB在自身反应性T细胞活化的早期促进了抗原特异性Treg的诱导，则它能够通过将正在经历活化的自身反应性T细胞转化成Treg洏延迟疾病的发病或者阻止疾病的进展

虽然BsB显示的效力有限(由于其对MHC-II和TCR的亲和力不高)，且循环半寿期短(这限制了它的暴露)但对幼龄NOD小鼠(4-6周龄)和年龄更大的NOD小鼠(9-12周龄)进行短期处理，可重复地延迟了这些NOD小鼠中T1D的发病但观察到的有益效果是有限的，而且不能持续用BsB更长期地(10周)处理NOD小鼠(4-13周龄)显著延迟了疾病发病，并减少了动物中T1D的发生率不拘于特定理论，该有益效果是诱导Treg的从头生成所带来的这些诱導Treg或是局部产生的(例如在胰腺中或在胰腺引流淋巴结中)，或者是远位产生后被募集到胰腺的用来保护胰岛免受自身反应性T细胞或其他非T細胞的白细胞的破坏。对于用BsB处理后保持无糖尿病的35周龄小鼠的胰腺组织切片的免疫组化染色清楚地表明在胰岛的周围有Foxp3⁺ Treg数目的增加直觀上，它们似乎在防止CD3⁺ T细胞和非T细胞的淋巴细胞进入胰岛在经BSB处理后在研究结束时保持无糖尿病的NOD小鼠的胰岛中有～50％观察到了该现象，但对照组中糖尿病动物的胰岛中无一观察到该现象在对照组中少数无糖尿病小鼠的胰岛保持没有淋巴细胞浸润且无胰岛炎。已知由于NOD尛鼠的遗传异质性在如此大小的组中，总是有少数动物在该时间范围内不会发生糖尿病在BsB处理组中其余的～50％的无糖尿病动物中，胰島也没有淋巴细胞浸润且无胰岛炎这些小鼠的无病状态的可能原因包括BsB处理以及遗传背景。

与组织病理学所见一致的是与未处理的对照相比，在BsB处理的动物(在9-12周龄处理)的血液中检测到了Foxp3⁺ Treg数目的较小但统计学显著的增加在更小的年龄(4周龄)开始处理的小鼠中，该增加不明顯不拘于特定理论，这可能是因为9周龄小鼠中经历活化的自身反应性T细胞比4周龄小鼠中更多4周龄小鼠中自身反应性T细胞的低水平可能導致无法检出对现存的Treg环境中的诱导Treg之外的诱导Treg。Treg的增加也是瞬时性的由于在接受抗CD3治疗的动物中也观察到类似的现象(Nishio et al.,2010)，可能是诱导的Treg鈈稳定丧失了Foxp3的表达。更可能的是Treg从循环中被募集到了受影响的靶组织。与之对比的是用CTLA-4Ig处理的NOD小鼠显示循环Treg数目显著减少。处理還加重了疾病表现在疾病发病加快，且显示显性疾病的动物的发生率更高与该结果一致的是，先前报道显示Treg内稳态牵涉共刺激途径，且共刺激的缺乏可减少Treg的产生在NOD小鼠中阻断或敲除CD80或CD86也导致T1D更早发病(Salomon

通常在4-9周龄的NOD小鼠的胰腺中观察到胰岛周围炎的出现。如果不加控制继而发生侵袭性胰岛炎，导致β-细胞完全破坏在12-35周龄发生显性糖尿病。已用BsB处理10周并在35周龄进行分析的无糖尿病NOD小鼠的胰腺显礻出胰岛周围炎的进展似乎已被阻止的证据。未见侵袭性胰岛炎或产胰岛素的β-细胞被过度破坏的征象有其他报道描述了在NOD小鼠中类似哋延迟或防止疾病的不同治疗介入(Shoda T细胞的雌性NOD/SCID小鼠相比，将致糖尿病性的耗竭了CD4⁺CD25⁺Treg的CD4⁺CD25^-BDC2.5 T细胞转移到雌性NOD/SCID小鼠中加速了侵袭性胰岛炎的发生侵襲性胰岛炎大体上主要是树突细胞(DC)、而非BDC2.5 T本身的浸润。作者基于其研究推测Treg通过调节(至少部分地调节)DC响应于胰岛分泌的趋化因子CCL19和CCL21的趋囮性来调控DC向胰岛中的侵袭性。在BsB处理的无糖尿病NOD小鼠的胰腺切片中见到的Foxp3⁺ Treg、CD3⁺ T细胞和非T细胞白细胞的免疫组化染色模式与他们的发现相一致(图12B)不拘于特定理论，NOD小鼠中响应于BsB而产生的Treg可能发挥作用以阻止自身反应性T细胞和非T细胞淋巴细胞向胰岛中迁移用BsB进行的更长期处悝更为有效，因为该处理生成了更稳健、持续的Treg诱导该观点得到了下述事实的支持：在细胞培养物中用BsB连续刺激诱导的Treg延长了Treg中Foxp3⁺的表达(Karman

茬自身免疫性疾病或器官移植动物模型中使用新鲜分离的、离体扩增的或体外诱导的Treg进行的细胞疗法已经显示，Treg过继性转移能够恢复Treg对效應T细胞的平衡从而控制与这些疾病相关的高度自身免疫(Allan et al.,2008；Jiang et al.,2006；Riley et al.,2009；Tang et al.,2012)。但是使用过继性转移作为治疗策略在临床应用上还面临若干难题。首先能够从人受试者的外周血分离的自体Treg的数量有限。因此往往需要进行大量的Treg离体扩增这可能改变Treg的功能性和纯度。其次由于分离嘚Treg是多克隆的，它们可能对非目标的效应T细胞产生泛免疫抑制作用第三，也是最重要的Treg的可塑性(plasticity)是不容忽视的挑战(Bluestone al.,2009b)，这会提高加重自身免疫或炎症的风险因此，能够在原位以抗原特异性方式诱导Treg生成的治疗手段比过继性Treg细胞疗法更为有利本文中提供的结果展示了这樣的一种可在小鼠T1D模型的背景下将CTLA-4与MHCII交联的作用剂(BsB)的实用性和有效性。响应于BsB处理共同显示IL-10、TGF-β和Treg的产生以及在T1D的NOD小鼠模型中的功效，囿可能提供一种新的治疗构思相比于其他免疫调节剂BsB还提供其他优势，因为其不影响静息T细胞(resting T cells)或其他淋巴细胞在我们的所有研究中，外周中的CD4⁺ T细胞和CD19⁺B细胞的数目和百分比保持不变不拘于特定理论，该手段能够有效地延迟或者阻止疾病进展更强力且具有更有利的药动學规律的BsB变体的开发应能验证这些研究。因此该构思可能也可应用于其他免疫介导的疾病的管理。

除非另有说明本文中报道的结果是使用下述方法和材料获得的。

Laboratory动物维持在无病原体设施中，依照美国卫生部颁布的指南(NIH Publication No 86-23)和Genzyme的内设动物照看和使用委员会颁布的指南进行研究

幼稚T细胞的分离.来自8-12周龄雌性BALB/c或OT-II小鼠的脾脏和淋巴结的幼稚T细胞通过磁力分离后续荧光激活细胞分选来加以纯化。细胞首先通过磁仂细胞分离(Miltenyi Biotech)进行负选择然后作为CD4⁺CD25^-CD62L^高CD44^低细胞加以分选，至纯度高于98％

抗原特异性Treg诱导测定.在同种异体MLR环境中的测定如前人报道(Karman et al.,2012)那样实施。对于抗原特异性T细胞活化在圆底96孔平板中将10⁵个幼稚OT-II T细胞与10⁵个经辐射的同基因APC在0.5μg/ml的Ova_323-329和1μg/ml的可溶性抗-CD28(克隆37.51，eBioscience)的存在下混合以饱和浓度100μg/ml向培养细胞中加入测试构建体、小鼠IgG2a或小鼠CTLA-4Ig。将细胞培养5天以诱导Treg的产生并通过流式细胞术分析。收集培养基使用ELISA试剂盒根据制造商的说明分析IL-2、IL-10和TGF-β。为了评估T细胞增殖，用5μM T细胞在37℃标记5min。然后洗涤它们以去除未结合的CFSE并如上所述地将它们用于Treg诱导测定。将细胞培养5天以让它们分裂然后通过流式细胞术分析。为了检测T细胞中的Foxp3⁺如上所述对细胞进行表面标志物染色，然后用Fix/Perm缓冲液(eBioscience)透化并用綴合有PE-Cy7的抗Foxp3抗体(克隆FJK-16s,eBioscience)染色。

BsB在小鼠中的药动学测量.测定了8周龄C57BL/6小鼠中BsB的药动学通过腹膜内注射将20mg/kg的BsB施用到小鼠中。在施用后1小时、5小时、24小时、48小时和72小时通过隐静脉取血收集血液利用ELISA测定测量每个时间点的BsB水平。简而言之将100μl溶于PBS的抗小鼠CD80抗体(1μg/ml)包被到96孔平板上，並在4℃温育过夜用5％胎牛血清将平板封闭1h，然后用PBS洗涤4次然后向孔中加入100μl不同稀释度的血样。将平板在轻柔震荡下室温温育2小时並用PBS洗涤4次。加入生物素化的抗小鼠LAG-3抗体(1μg/ml)并温育2小时用PBS将平板洗涤4次，然后加入链亲和素-HRP30min后，用PBS将平板洗涤6次再对平板显色以进荇比色测量。使用在测定稀释剂中稀释到不同浓度的纯化BsB作为标准物

BsB如上所述地处理4周。对于更长期的处理将NOD小鼠从4周龄到13周龄用BsB或鹽水如上所述地处理10周。从8周龄开始每周监测非空腹血液葡萄糖水平当小鼠的葡萄糖读数连续3次读数均高于300mg/dL时则认为小鼠有糖尿病。在處理2周之后通过流式细胞术检查外周血中的Foxp3⁺ Biosciences)裂解红细胞5min洗涤之后，将细胞固定、透化并用FITC标记的抗-Foxp3抗体如上所述地染色30min。将胰腺切为兩半一半在中性缓冲液福尔马林中固定，另一半置于OCT化合物上然后在干冰上冷冻

组织病理学分析.对于中性缓冲液福尔马林固定的胰腺，使用自动化处理器进行CD3、Foxp3⁺细胞染色组织切片用二甲苯-乙醇脱蜡，在柠檬酸缓冲液中温育25min修复抗原然后用血清封闭。将玻片与抗-CD3抗体溫育45min然后与山羊抗兔辣根过氧化物酶聚合物温育20min。通过与3,3’-二氨基联苯胺四盐酸温育2-4min获得CD3的生色团可视化为了监测Foxp3⁺，用血清再次封闭切片然后暴露于抗-Foxp3抗体45min。然后将玻片与兔抗大鼠IgG抗体温育30min然后与山羊抗兔碱性磷酸酶聚合物温育。用Fast Red 10min实现生色团可视化组织切片用蘇木精复染2min，在步骤之间用0.05％Tween-20/Tris缓冲盐水洗涤3次用抗胰岛素抗体如上所述地对邻近的系列切片染色。使用附带有Diagnostic Inc.产的数字照相机的Nikon Eclipse E800荧光显微镜拍照并使用Spot Advanced软件捕捉图像。

小鼠替身构建体(基因1)的核苷酸序列:

小鼠替身构建体(基因1)的翻译的蛋白序列:

小鼠替身构建体(基因2)核苷酸序列:

小鼠替身构建体(基因2)的翻译的蛋白序列:

从前面的描述容易看出可以对本申请中描述的发明进行变化和修改，以将其适用于不同的用途囷条件这样的实施方案也落入随附的权利要求的范围。

本申请中对变量的任何定义中记载的要素列表均包括将该变量限定为该要素列表Φ的任何单一要素或要素的组合(或子组合)本文中对某个实施方案的记载均包括该实施方案作为单一实施方案或者与任何其他实施方案或其他实施方案的部分的组合。

本申请通过援引并入本说明书中提到的所有专利和出版物其程度如同具体地通过援引一一并入每个单独的專利和出版物。